最新微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案

1、微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案六、驗(yàn)證內(nèi)容1.供試液的制備1.1.取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，充分振搖使混勻，作為1:10的供試液。1.2.取1:10供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，充分振搖使混勻，作為1:100的供試液。1.3.取1:100供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，充分振搖使混勻，作為1:1000的供試液。備注：供試液制備若需加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不超過45。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過1小時(shí)。2.菌液制備2.1.接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新

2、鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824小時(shí)；分別取上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，依次稀釋至、制成每1ml含菌數(shù)為小于100cfu的菌懸液。2.2.接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，2025培養(yǎng)23天；取此培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，依次稀釋至，制成每1ml含菌數(shù)為小于100cfu的菌懸液。2.3.將黑曲霉菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)57天，使大量的孢子成熟。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0

3、無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。然后，采用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液依次稀釋至，制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。2.4.上述菌懸液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)之內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗(yàn)證過的貯存有效期內(nèi)使用。3.計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證3.1.需氧菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)（平皿法）所加菌液的體積不得超過供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性檢查。3.1.1.試驗(yàn)組取

4、上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液、混勻，使每1ml供試液或每張濾膜過濾的供試液中含菌量不大于100cfu。取的供試液9.9ml和小于10000cfu的銅綠假單胞菌菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。平行制備2個(gè)平皿。取的供試液9.9ml和小于10000cfu的金黃色葡萄球菌菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。平行制備2個(gè)平皿。取的供試液9.9ml和小于10000cfu的枯草芽孢桿菌菌懸液0.1ml混勻

5、后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。平行制備2個(gè)平皿。取的供試液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。平行制備2個(gè)平皿。取的供試液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。平行制備2個(gè)平皿。取的供試液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌懸液

6、0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于2025倒置培養(yǎng)5天點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。平行制備2個(gè)平皿。取的供試液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌懸液0.1ml混勻后，吸取1ml注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基1520ml，混勻，凝固，于2025倒置培養(yǎng)5天點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。平行制備2個(gè)平皿。3.1.2.菌液組取小于100cfu的銅綠假單胞菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液、枯草芽孢桿菌菌懸液、白色念珠菌菌懸液、黑曲霉菌懸液各1ml，注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基約1520ml，混勻，凝固，于3035倒置培養(yǎng)3天點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。各平行制備

7、2個(gè)平皿。取小于100cfu的白色念珠菌菌懸液、黑曲霉菌懸液各1ml，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基各1520ml，混勻，凝固，于2025倒置培養(yǎng)5天點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。各平行制備2個(gè)平皿。3.1.3.供試品對(duì)照組取的供試液1ml，注入平皿中，分別立即傾注1520ml溫度不超過45胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基3035倒置培養(yǎng)3天點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基2025倒置培養(yǎng)5天點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。各組平行制備2個(gè)平皿。3.1.4.結(jié)果判斷3.1.4.1計(jì)算公式： 稀釋劑對(duì)照組菌數(shù)的回收率=（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)）/菌液組的平均菌落數(shù)

8、試驗(yàn)組菌數(shù)的回收率=（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)）/菌液組的平均菌落數(shù)3.1.4.2判定標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)組、稀釋劑對(duì)照組（如有）的菌數(shù)回收率應(yīng)在0.52之間。若各試驗(yàn)菌的回收率均符合規(guī)定，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。3.1.5試驗(yàn)結(jié)果供試品批號(hào)、。菌種類型試驗(yàn)次數(shù)菌液組實(shí)驗(yàn)組供試品對(duì)照組回收率銅綠假單胞菌1平均2平均3平均金黃色葡萄球菌1平均2平均3平均枯草芽孢桿菌1平均2平均3平均白色念珠菌（需氧菌驗(yàn)證）1平均2平均3平均黑曲霉（需氧菌驗(yàn)證）1平均2平均3平均白色念珠菌（霉菌、酵母菌驗(yàn)證）1平均2平均3平均黑曲霉（霉菌、酵母菌驗(yàn)證

9、）1平均2平均3平均結(jié)果判定：驗(yàn)證人： 復(fù)核人：日期： 日期：4.控制菌檢查4.1.（大腸埃希菌）的驗(yàn)證4.1.1.試驗(yàn)組取的供試液ml（取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液），小于100cfu的大腸埃希菌菌懸液1ml，加至約100ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，于3035培養(yǎng)1824小時(shí)。4.1.2.陰性對(duì)照組取pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液10ml，加至約100ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，于3035培養(yǎng)1824小時(shí)。4.1.3.陽性對(duì)照組取小于100cfu的大腸埃希菌菌懸液1ml，加至約100ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，于3035培養(yǎng)1824小時(shí)。4.1.4.檢查取上述培養(yǎng)物1ml，接種至含1

10、00ml麥康凱液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，4244培養(yǎng)2448小時(shí)。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上3035培養(yǎng)1872小時(shí)。檢查結(jié)果如下：第一次試驗(yàn)結(jié)果：供試品批號(hào)：序號(hào)步驟實(shí)驗(yàn)組陽性對(duì)照組 陰性對(duì)照組1胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，3035培養(yǎng)1824小時(shí) 2麥康凱液體培養(yǎng)基，4244培養(yǎng)2448小時(shí)3取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，3035培養(yǎng)1872小時(shí)若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn), 確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判未檢出大腸埃希菌。4分離純化、染色鏡檢、生化試驗(yàn)等結(jié)果：第二次

11、試驗(yàn)結(jié)果：供試品批號(hào)：序號(hào)步驟實(shí)驗(yàn)組陽性對(duì)照組 陰性對(duì)照組1胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，3035培養(yǎng)1824小時(shí) 2麥康凱液體培養(yǎng)基，4244培養(yǎng)2448小時(shí)3取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，3035培養(yǎng)1872小時(shí)若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn), 確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判未檢出大腸埃希菌。4分離純化、染色鏡檢、生化試驗(yàn)等結(jié)果：第三次試驗(yàn)結(jié)果：供試品批號(hào)：序號(hào)步驟實(shí)驗(yàn)組陽性對(duì)照組 陰性對(duì)照組1胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，3035培養(yǎng)1824小時(shí) 2麥康凱液體培養(yǎng)基，4244培養(yǎng)2448小時(shí)3取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，3035培養(yǎng)1872小時(shí)若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn), 確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判未檢出大腸埃希菌。4分離純化、染色鏡檢、生化試驗(yàn)等結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)：陽性對(duì)照和試驗(yàn)組應(yīng)檢出大腸埃希菌，陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長(zhǎng)。 結(jié)果判定：驗(yàn)證人： 復(fù)核人：日期： 日期：備注：采用以上供試液制備方法，分別對(duì)需氧菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)和控制菌檢查法進(jìn)行方法驗(yàn)證時(shí)，若結(jié)果不