LC Software中文說明書簡易

1、LightCycler480 Software 1.5軟件操作（中文版）第一部分 基本界面及圖標(biāo)概述：一、 Overview界面 Exit：關(guān)閉LC480軟件 Log off：從目前使用的數(shù)據(jù)庫中退出并可登陸其他的數(shù)據(jù)庫 Overview：點(diǎn)擊該圖標(biāo)進(jìn)入“Overview”界面 Navigator：點(diǎn)擊該圖標(biāo)進(jìn)入“Navigator”界面，可進(jìn)行數(shù)據(jù)的導(dǎo)入導(dǎo)出等操作，詳見。 Save：點(diǎn)擊該圖標(biāo)進(jìn)行保存 Export：導(dǎo)出當(dāng)前打開的文件 Close： 關(guān)閉當(dāng)前打開的文件 Print： 打印當(dāng)前打開的窗口 Tools：打開“Tools”界面，可進(jìn)行密碼修改，建立和編輯用戶，系統(tǒng)設(shè)置，查看數(shù)據(jù)庫狀

2、態(tài)、儀器狀態(tài)、濾光片組合等操作 Help：查看軟件版本，操作說明書等二、New Experiment 界面 Run Module：編輯、運(yùn)行或查看PCR程序及查看PCR實(shí)時(shí)數(shù)據(jù) Subset Editor：點(diǎn)擊該模塊后可進(jìn)行子集的編輯 Sample Editor：點(diǎn)擊后進(jìn)行樣品信息的編輯 Analysis Module: 點(diǎn)擊進(jìn)行結(jié)果分析或查看已保存的分析結(jié)果 Report Module：選擇需要的內(nèi)容以報(bào)告的形式給出結(jié)果 Summary Module : 查看實(shí)驗(yàn)的總體概況，包括實(shí)驗(yàn)名稱，所用的程序，檢測模式，濾光片組合等。概況的內(nèi)容由系統(tǒng)自動(dòng)生成三、Navigator 界面 Import：

3、導(dǎo)入一個(gè)文件 Export：導(dǎo)出一個(gè)文件 Batch Import：導(dǎo)入一批數(shù)據(jù) Batch Export：導(dǎo)出一批數(shù)據(jù) New：新建一個(gè)實(shí)驗(yàn)或文件夾 New Folder：新建一個(gè)文件夾 Open：打開一個(gè)文件 Rename：重命名 Delete：刪除選中的目標(biāo) Copy： 拷貝選中的目標(biāo)Note：所有上述圖標(biāo)在深藍(lán)色時(shí)為激活狀態(tài)，灰色時(shí)為滅活狀態(tài)也就是不可用狀態(tài)。各圖標(biāo)的功能在不同狀態(tài)下以顏色來區(qū)分是否具備。軟件操作一打開軟件 打開電腦，Windows操作系統(tǒng)的用戶名為operator，密碼為LC480（區(qū)分大小寫），電腦操作系統(tǒng)啟動(dòng)完畢，檢查電腦右下角是否有圖標(biāo)。如果沒有，點(diǎn)擊桌面“Ex

4、or4 for XDMS_R”快捷方式文件。然后右鍵點(diǎn)擊圖標(biāo)，左鍵點(diǎn)擊“Show”一欄，如最后一句話顯示“Exor 4 server is running”表示數(shù)據(jù)庫加載成功。如果顯示“Exor 4 failed to start”則表示數(shù)據(jù)庫沒有加載上，關(guān)閉該窗口，右鍵點(diǎn)擊圖標(biāo)，選“Shutdown”一欄，退出數(shù)據(jù)庫，重新點(diǎn)擊桌面“Exor4 for XDMS_T”文件，加載數(shù)據(jù)庫。 然后點(diǎn)擊桌面“LightCycler480 Software”快捷方式文件，運(yùn)行該軟件。輸入用戶名和密碼。用戶名默認(rèn)為admin（管理者權(quán)限），密碼為LightCycler480（區(qū)分大小寫）或Master1，

5、如用戶已經(jīng)建立新用戶名，則可以按照新用戶名登錄。二用戶管理為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效管理，可以建立不同級(jí)別的用戶。如: 標(biāo)準(zhǔn)用戶（Standard User）、專業(yè)用戶（Expert User）、管理者（Local Administrator）。一般實(shí)驗(yàn)室建議建立專業(yè)用戶（Expert User）用戶名，然后以該用戶名登錄軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。 建立新用戶操作：打開LightCycler480 操作軟件，點(diǎn)擊右側(cè)按鈕打開“Tools”工具欄，選擇“User Access/Users and Groups”選項(xiàng)。在右邊窗口中點(diǎn)擊“New User”鍵，在右邊“Enter the users full nam

6、e”一欄中填寫用戶的全名，在“”Enter the name the user wants to log in as”一欄填寫用戶登錄名，在“Enter the users password”一欄中輸入密碼（密碼須含有6個(gè)以上字母，1個(gè)以上數(shù)字，其中有至少一個(gè)字母大寫），在“Confirm the password”一欄中重新輸入一次密碼，加以確認(rèn)，在“Select the users role”一欄中選擇用戶級(jí)別，然后點(diǎn)擊右下方“Close”按鈕加以確認(rèn)。 在 “Tools”工具欄中的“System Settings”界面中可以設(shè)置各用戶級(jí)的權(quán)限，以及密碼的時(shí)效。三儀器自檢每次開機(jī)時(shí)，儀器會(huì)

7、自動(dòng)進(jìn)行初始化自檢程序。自檢通過，儀器左側(cè)指示燈變綠。如放置了樣本，儀器右側(cè)指示燈變綠。在自檢時(shí)，不能放置反應(yīng)板，否則自檢無法通過。四建立實(shí)驗(yàn)程序 打開LightCycler480 操作軟件，成功登錄后點(diǎn)擊按鈕，進(jìn)入New Experiment/Run Protocol程序設(shè)置界面。在“Detection Format”一欄中選擇所使用的熒光檢測技術(shù)，可選擇各類探針和染料，如常見的SYBR Green I染料、Mono Color Hydrolysis Probe單色TaqMan水解探針、Multi Color Hydrolysis Probe多色TaqMan水解探針。在進(jìn)行多色熒光PCR實(shí)驗(yàn)

8、時(shí)，須點(diǎn)擊按鈕選擇用戶所采用的熒光檢測通道，點(diǎn)擊“”確認(rèn)。 在一欄中填寫反應(yīng)體積。在“Programs”界面中設(shè)置實(shí)驗(yàn)程序：在“Program Name”下方命名程序，“Cycles”一欄內(nèi)填寫該程序的循環(huán)數(shù)，在“Analysis Mode”一欄選擇該程序的分析模式。定量分析選擇“Quantification”，溶解曲線分析選擇“Melting Curves”，顏色補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)選擇“Color Compensation”。而后在“Temperature Targets”界面內(nèi)設(shè)置所指定程序的內(nèi)容，在“Target()”處填寫目標(biāo)溫度，“Acquisition Mode”處選擇信號(hào)采集方式，“Hol

9、d”一欄填寫該溫度所持續(xù)的時(shí)間，“Ramp Rate(/s)”處填寫升降溫速率（注：如目標(biāo)溫度為50以下時(shí)，為了減少硬件的損耗，必須將降溫速率調(diào)至1.5/s以下）。如一個(gè)程序有多個(gè)步驟，則在Temperature Targets界面的左側(cè)處點(diǎn)擊，增加步驟；也可點(diǎn)擊上下箭頭調(diào)整各步驟的先后順序。如一個(gè)實(shí)驗(yàn)中有多個(gè)程序，也可在“Programs”界面左側(cè)點(diǎn)擊，增加程序，也可點(diǎn)擊上下箭頭調(diào)整各程序的先后順序。實(shí)驗(yàn)程度設(shè)置完成后，在下方“Overview”界面內(nèi)會(huì)自動(dòng)生成溫度隨時(shí)間變化的溫控曲線，以及估計(jì)的運(yùn)行時(shí)間，綠色點(diǎn)表示采集熒光信號(hào)的溫度和時(shí)間點(diǎn)?？梢砸勒赵搱D檢查一下程度設(shè)置是否正確。設(shè)置好的實(shí)

10、驗(yàn)程序可以保存成模板文件，下次使用同樣的實(shí)驗(yàn)程序時(shí)可以調(diào)用。具體操作如下：點(diǎn)擊按鈕右側(cè)的下拉箭頭，選中“Save As Template”選項(xiàng)，系統(tǒng)默認(rèn)將實(shí)驗(yàn)程序模板文件保存在所登錄的用戶名下“Templates”目錄中，用戶可將其存放在其下的子目錄“Run Templates”下，填寫該程序模板文件的名稱，點(diǎn)擊“”按鈕即完成保存。調(diào)用模板程序時(shí)可點(diǎn)擊“Apply Template”按鈕，從目錄樹中選定所要調(diào)用的模板，點(diǎn)擊“”按鈕確認(rèn)。五樣本設(shè)置1、樣本亞組編輯：LightCycler480軟件擁有一個(gè)獨(dú)特的樣本編輯管理功能亞組編輯（Subset Editor），即將反應(yīng)板上所有的樣本根據(jù)用戶

11、需要分成亞組，對(duì)亞組進(jìn)行獨(dú)立地分析定量。具體操作如下： 在“New Experiment”界面中，點(diǎn)擊左側(cè)按鈕，進(jìn)入Subset設(shè)置界面，點(diǎn)擊按鈕新建亞組，并給其命名。點(diǎn)擊按鈕可復(fù)制所選定的亞組，點(diǎn)擊按鈕可更改所選定亞組的名稱，點(diǎn)擊“Delete”按鈕可刪除所選定的亞組。設(shè)置亞組：在Subsets界面中選定要設(shè)置的亞組名，在右邊反應(yīng)板孔位處選定該亞組所包含的孔位，使所選定的孔位中都出現(xiàn)深蘭色凹陷的，點(diǎn)擊下方按鈕加以確認(rèn)。設(shè)置亞組可以在一塊反應(yīng)板上實(shí)現(xiàn)多個(gè)檢測項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)，前提是這些檢測項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行程序都一致（這在使用TaqMan水解探針時(shí)比較容易實(shí)現(xiàn)），由于各檢測項(xiàng)目均有各自的質(zhì)控對(duì)照，因而，

12、設(shè)定亞組可以單獨(dú)對(duì)各檢測項(xiàng)目進(jìn)行分析。2樣本屬性編輯點(diǎn)擊New Experiment界面左側(cè)按鈕設(shè)置樣本信息。在“Workflow”一欄在選擇實(shí)驗(yàn)方案：Abs Quant：絕對(duì)定量或定性分析；Rel Quant：相對(duì)定量；Scanning：基因掃描；Color Comp：顏色補(bǔ)償；Tm：熔解溫度檢測；Melt Geno：熔解曲線法基因分型；Endpt Geno：終點(diǎn)法基因分型。在Select Samples/Subset選項(xiàng)中選定待編輯的樣本亞組：在界面右方編輯各樣本的名稱屬性等：Pos：樣本在96孔板或384孔板上的座標(biāo)位置；Repl Of：重復(fù)樣本設(shè)置；Sample Name：樣本名稱；Q

13、uantification Sample Type：定量樣本類型；Concentration：濃度；Target Name：檢測類型。 在進(jìn)行絕對(duì)定量檢測實(shí)驗(yàn)時(shí)，參與實(shí)驗(yàn)的樣本有標(biāo)準(zhǔn)品（一般4至5個(gè)）、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、未知樣本。各樣本的名稱可參考以上“Sample Name”中的命名習(xí)慣（STD表示標(biāo)準(zhǔn)品、NC表示陰性對(duì)照、Positive表示陽性對(duì)照、Sample表示待檢測的未知樣本），也可以自行編輯。 在“Quantification Sample Type”一欄內(nèi)需要對(duì)各樣本的類型進(jìn)行明確地編輯（標(biāo)準(zhǔn)品選Standard類型、陰性對(duì)照選Negative Control類型、陽性對(duì)照選

14、Positive Control類型、未知樣本選Unknown類型），此外標(biāo)準(zhǔn)品系已知濃度的陽性樣本，其設(shè)定為Standard類型后還需在Concentration一欄中對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)品分別設(shè)定其相應(yīng)的濃度，以及在Abs Quant/Units填寫框中填寫相應(yīng)的濃度單位，如copies、pg等。 在Target Name一欄中可以填寫該檢測實(shí)驗(yàn)所要檢測的指標(biāo)，如乙肝病毒、禽流感病毒、沙門氏菌等。 如在實(shí)驗(yàn)中需要設(shè)置重復(fù)樣本的，可在Repl Of一欄中填寫該樣本其所重復(fù)的樣本的座標(biāo)號(hào)（注意，只能填寫座標(biāo)號(hào)，不能填寫樣本名）。 如進(jìn)行的是多色熒光PCR檢測實(shí)驗(yàn)，則在Select Filter Combi

15、nations一欄中選定各檢測通道，分別進(jìn)行樣本編輯。 在進(jìn)行定性檢測實(shí)驗(yàn)時(shí)，參與實(shí)驗(yàn)的樣本有陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、未知樣本。設(shè)置相應(yīng)較簡單，可參考以下設(shè)置六運(yùn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)程序和樣本均設(shè)置完畢后，即可運(yùn)行實(shí)驗(yàn)，具體操作：進(jìn)入“New Experiment”界面，點(diǎn)擊左側(cè)按鈕，如反應(yīng)板已經(jīng)放入儀器，儀器主機(jī)正面右側(cè)的LED燈會(huì)由桔黃色變?yōu)榫G色，軟件界面右下邊的這時(shí)點(diǎn)擊“Start Run”按鈕，軟件界面跳出一對(duì)話框提示用戶給該實(shí)驗(yàn)文件命名，以保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一般建設(shè)用戶以時(shí)間命名，以方便日后查找實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如20080816-HBV-1，20080817-AIV-2等。命名后點(diǎn)擊確認(rèn)鍵，儀器就開始運(yùn)行了

16、，在運(yùn)行過程中可觀察到溫度和熒光信號(hào)的變化曲線。如進(jìn)行多重?zé)晒釶CR實(shí)驗(yàn)，可在熒光歷史“Fluorescence History”界面內(nèi)上的下拉菜單中切換不同的檢測通道，以分別觀察其擴(kuò)增情況。 在實(shí)驗(yàn)運(yùn)行過程中，用戶可以根據(jù)需要，點(diǎn)擊“10 Cycles”按鈕增加正在運(yùn)行的程序10個(gè)循環(huán)，也可以點(diǎn)擊“End Program”按鈕終止正在運(yùn)行的子程序，直接進(jìn)入下一個(gè)子程序。七數(shù)據(jù)分析（定性和定量）實(shí)驗(yàn)運(yùn)行完畢后，點(diǎn)擊界面左側(cè)的按鈕分析數(shù)據(jù)。或者打開LightCycler480軟件，成功登錄后點(diǎn)擊右側(cè)圖標(biāo)，進(jìn)入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定之前已完成的實(shí)驗(yàn)文件，點(diǎn)擊下方“Open”按鈕

17、，或雙擊文件名打開實(shí)驗(yàn)文件，點(diǎn)擊左側(cè)按鈕，進(jìn)入分析界面。在“Create new analysis”窗口內(nèi)顯示了可使用的分析方法，在“Open existing analysis”窗口內(nèi)顯示已經(jīng)進(jìn)行分析的結(jié)果內(nèi)容。要進(jìn)行定性和定量分析可以選擇Abs Quant分析功能，其有兩種分析模式，2nd Derivative Max二階最大求導(dǎo)法和Fit Points點(diǎn)擬合法。選定分析功能類型后會(huì)跳出對(duì)話框，用戶可以自行選擇分析類型、選擇要分析的亞組（Subset），以及命名分析結(jié)果（Name）。點(diǎn)擊“”按鈕確認(rèn)。在Analysis界面中選擇Abs Quant2nd Derivative Max，點(diǎn)擊“

18、Calculate”按鈕，生成Cp值，如實(shí)驗(yàn)中有標(biāo)準(zhǔn)品，則同時(shí)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且計(jì)算出各未知樣本的濃度值。該方法在反應(yīng)體系優(yōu)化得比較成熟，信號(hào)噪音比較低時(shí)使用較好。有時(shí)從原始熒光曲線能觀察到有個(gè)別樣本的曲線不正常，信號(hào)噪音比較高，則可選用Fit Points點(diǎn)擬合法加以人工調(diào)整。具體操作如下：在Analysis界面中選擇Abs QuantFit Points，在“Cycle Range”中First Cycle和Last Cycle兩欄分別設(shè)置分析數(shù)據(jù)的起始和終止循環(huán)數(shù)。選定具體數(shù)據(jù)后，軟件只分析該區(qū)間內(nèi)的實(shí)驗(yàn)曲線。“Background”一欄設(shè)置熒光信號(hào)本底的區(qū)域，一般將熒光值呈S形曲線增長

19、前趨于水平的循環(huán)區(qū)域作為背景本底區(qū)。點(diǎn)擊“Noise Band”按鈕，上下移動(dòng)紅色的噪音本底線來消除個(gè)別樣本由于信號(hào)噪音較高而對(duì)結(jié)果造成的影響。一般將紅線置于盡可能低，但又要足以蓋過陰性線和曲線不平的噪音線，與熒光信號(hào)曲線交于線性增長區(qū)。軟件只分析紅色噪音本底線上方的曲線數(shù)據(jù)，所以要確保其上方無曲折不平的噪音信號(hào)。點(diǎn)擊“Analysis”按鈕，再點(diǎn)擊“Threshold”按鈕，使用顯示“Auto”字樣，然后點(diǎn)擊下方按鈕，生成各樣本的CP值。若是定量分析，則會(huì)生成各標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及各樣本的濃度值。點(diǎn)擊軟件右側(cè)的圖標(biāo)，將分析結(jié)果保存入實(shí)驗(yàn)文件，或在目錄樹中另找保存位置。 在進(jìn)行多色熒光PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，

20、同時(shí)使用相鄰兩個(gè)檢測通道進(jìn)行檢測需要通過顏色補(bǔ)償功能來校正相鄰?fù)ǖ赖臒晒庑盘?hào)干擾，詳見顏色補(bǔ)償一章。八報(bào)告生成 打開一個(gè)分析完結(jié)果的文件，或者剛分析完結(jié)果并貯存后，點(diǎn)擊左側(cè)工具欄中按鈕，進(jìn)入結(jié)果報(bào)告的界面?？稍凇癎eneral”和“Detailed”兩欄中選擇實(shí)驗(yàn)報(bào)告所要包含的內(nèi)容?！癎eneral”一欄中顯示的選項(xiàng)為本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均需要顯示的報(bào)告參數(shù)；“Detailed”一欄則顯示本次實(shí)驗(yàn)多次分析中所要的報(bào)告參數(shù)的明細(xì)。點(diǎn)擊“Generate”按鈕，生成報(bào)告預(yù)覽。點(diǎn)擊右上方“PDF”按鈕可將報(bào)告保存為*.pdf文件。 報(bào)告顯示所包括的內(nèi)容可以保存成模板文件，同類報(bào)告要求的實(shí)驗(yàn)可以調(diào)用相同的報(bào)告

21、模板。在“General”和“Detailed”兩欄中選定了內(nèi)容后點(diǎn)擊下方按鈕右側(cè)的下拉箭頭，點(diǎn)擊“Save As Template”將其保存至Templates/Report Templates目錄下，點(diǎn)擊“”按鈕確認(rèn)。調(diào)用報(bào)告模板時(shí)點(diǎn)擊“Apply Template”按鈕，選定模板文件，點(diǎn)擊“”按鈕確認(rèn)。九數(shù)據(jù)導(dǎo)出與導(dǎo)入該軟件所產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均保存在其自帶的數(shù)據(jù)庫中，從Windows操作系統(tǒng)中無法找到其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的文件。這樣可以很好地保護(hù)實(shí)驗(yàn)文件不被誤刪和竊取。如用戶希望將實(shí)驗(yàn)結(jié)果備份保存，可以將數(shù)據(jù)從數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出生成可見的文件，保存于其它電腦中或本電腦的其它目錄下。同時(shí)，也可以將實(shí)驗(yàn)文件導(dǎo)

22、入數(shù)據(jù)庫查看文件內(nèi)容或?qū)ξ募M(jìn)行分析。導(dǎo)出單個(gè)實(shí)驗(yàn)文件的方法：打開LightCycler480軟件，成功登錄后點(diǎn)擊右側(cè)圖標(biāo)，進(jìn)入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定實(shí)驗(yàn)文件，點(diǎn)擊下方按鈕，選擇保存文件的目錄位置，點(diǎn)擊“Save”按鈕將文件導(dǎo)出。 導(dǎo)出整個(gè)文件夾中所有文件的方法：打開LightCycler480軟件，成功登錄后點(diǎn)擊右側(cè)圖標(biāo)，進(jìn)入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定要導(dǎo)出文件所在的文件夾，點(diǎn)擊按鈕，在“Select Folders”一欄中選定保存預(yù)導(dǎo)出文件的目錄，點(diǎn)擊按鈕，將所要導(dǎo)出的文件目錄均選至右側(cè)對(duì)話框，點(diǎn)擊進(jìn)入“Target”界面，點(diǎn)擊“Browse”按鈕選定導(dǎo)

23、出的文件所要存放的目錄，點(diǎn)擊“Next”按鈕進(jìn)入“Options”界面，去除不需要導(dǎo)出的文件前的“”，用戶也可設(shè)定導(dǎo)出文件的限制。點(diǎn)擊“Next”按鈕，進(jìn)入“Start”界面，點(diǎn)擊“Next”按鈕，軟件顯示文件導(dǎo)出的過程和狀態(tài)，完成后進(jìn)入“Done”界面，顯示導(dǎo)出文件的報(bào)告。點(diǎn)擊“Done”按鈕確認(rèn)。 導(dǎo)入單個(gè)文件的方法：打開LightCycler480軟件，成功登錄后點(diǎn)擊右側(cè)圖標(biāo)，進(jìn)入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定實(shí)驗(yàn)文件，點(diǎn)擊下方“Import”按鈕，選定所要導(dǎo)入的文件，點(diǎn)擊“Open”按鈕，即導(dǎo)入該文件。 導(dǎo)入整個(gè)文件夾中所有文件的方法：打開LightCycler480軟件，

24、成功登錄后點(diǎn)擊右側(cè)圖標(biāo)，進(jìn)入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定實(shí)驗(yàn)文件，點(diǎn)擊下方“Batch Import”按鈕，進(jìn)入“Source”界面，點(diǎn)擊“Add”按鈕選定待導(dǎo)入的文件所在的文件夾，點(diǎn)擊“Next”按鈕，進(jìn)入“Target”界面，選定放置導(dǎo)入文件的文件夾，點(diǎn)擊“Next”按鈕進(jìn)入“Start”界面，點(diǎn)擊“Next”按鈕，進(jìn)入“Status”界面，開始導(dǎo)入文件，最后進(jìn)入“Done”界面，生成導(dǎo)入文件報(bào)告，點(diǎn)擊“Done”確認(rèn)。十單點(diǎn)定標(biāo) 同一種同一批號(hào)的試劑盒以相同的反應(yīng)程序進(jìn)行多輪定量檢測實(shí)驗(yàn)時(shí)，無須每次都做四至五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品來作標(biāo)準(zhǔn)曲線。第一輪檢測實(shí)驗(yàn)成功完成后，可以將該實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的

25、標(biāo)準(zhǔn)曲線保存下來，下一輪檢測實(shí)驗(yàn)時(shí)，只需選與第一輪實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)的一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品參與實(shí)驗(yàn)即可。在分析數(shù)據(jù)時(shí)可以調(diào)用第一輪的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的保存：使用四至五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品以及多個(gè)未知樣本進(jìn)行檢測實(shí)驗(yàn)后，分析數(shù)據(jù)，最終得到數(shù)據(jù)結(jié)果后，點(diǎn)擊標(biāo)準(zhǔn)曲線下方“Std Curve (In run) ”右側(cè)下拉前頭，選中 “Save as external”選項(xiàng)。命名標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將其保存于Special DataStd Curve文件夾下，點(diǎn)擊“”按鈕確認(rèn)。 已有標(biāo)準(zhǔn)曲線的調(diào)用：在使用單點(diǎn)定標(biāo)的檢測實(shí)驗(yàn)中，所選用的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品仍然定義為“Standard”類型，并且其濃度在已有的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi)。在分析

26、數(shù)據(jù)時(shí)，一開始無標(biāo)準(zhǔn)曲線生成，點(diǎn)擊“Standard Curve(In Run)”按鈕右側(cè)下拉箭頭，選中“Std Curve(external)”選項(xiàng)，雙擊所要調(diào)用的標(biāo)準(zhǔn)曲線文件，點(diǎn)擊“Calculate”按鈕，即可調(diào)用先前實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)的定量分析。 注意：保存標(biāo)準(zhǔn)曲線文件時(shí)所采用的分析模式必須與調(diào)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的分析模式一致才能成功調(diào)用標(biāo)準(zhǔn)曲線。十一相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析 進(jìn)行相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意，一般而言，每個(gè)樣本均做三個(gè)重復(fù)，以得到標(biāo)準(zhǔn)誤的數(shù)據(jù)，進(jìn)行相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)時(shí)樣本編輯最關(guān)鍵，樣本編輯正確了，分析數(shù)據(jù)完全可以一鍵完成。1、 相似相對(duì)定量 所謂相似相對(duì)定量是指默認(rèn)看家基因和靶

27、基因這兩對(duì)引物的PCR擴(kuò)增效率均為2.00時(shí)進(jìn)行的相對(duì)定量的算法，其主要是以Cp值的差值來推算濃度的差異。PCR手冊(cè)規(guī)定，靶基因和看家基因這兩對(duì)引物的PCR擴(kuò)增效率差異不超過0.1的情況下，可進(jìn)行相似相對(duì)定量計(jì)算，看一下某基因mRNA水平表達(dá)量變化的趨勢，如果其擴(kuò)增效率差異超過0.1，則不能使用相似相對(duì)定量算法（否則在很多期刊發(fā)文章時(shí)會(huì)被要求補(bǔ)實(shí)驗(yàn)或重新做定量實(shí)驗(yàn)）。出現(xiàn)這種情況時(shí)，方法一：重新設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化反應(yīng)體系，使擴(kuò)增效率差異小于0.1；方法二：采用準(zhǔn)確相對(duì)定量算法，見下第2。 進(jìn)行相似相對(duì)定量時(shí)，可同時(shí)設(shè)定多個(gè)靶基因跟同一個(gè)看家基因進(jìn)行比較。如下圖：三個(gè)樣本，分別用一個(gè)看家基因Refe

28、rence Gene，兩個(gè)不同靶基因Target A 和Target B進(jìn)行相對(duì)定量。在建立了含有所有本次實(shí)驗(yàn)中檢測樣本孔位的Subset后，點(diǎn)擊按鈕，在Rel Quant相對(duì)定量界面內(nèi)設(shè)置樣本信息。 在Repl of 一欄中填寫其所要重復(fù)試驗(yàn)的樣本的座標(biāo)號(hào)，如在A2和A3位進(jìn)行A1位樣本的兩次重復(fù)試驗(yàn)，則在A2和A3位的Repl of 一欄填寫A1即可。 在Sample Name一欄填寫樣本名，注意，只要是加同一模板的反應(yīng)孔位，均給其命名為相同的樣本名。例如A1、B1、C1孔位，雖然是用不同的引物分別擴(kuò)增不同的基因，但所加的樣本模板是相同的，所以在Sample Name一欄中填寫相同的樣本名

29、，可以用鍵盤“Ctrl+C”復(fù)制Reference Gene的樣本名，然后用鍵盤“Ctrl+V”粘貼至Target Gene A和Target Gene B的樣本名中，以確保所命名一致。另外，一定要設(shè)置陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，即其它反應(yīng)體系均不變，只是不加PCR模板的質(zhì)控，一般命名為NC或NTC（No Template Control） 在Sample Type一欄中分別選擇各樣本的不同類型?？醇一虻臋z測孔位均選擇帶有Reference的類型，靶基因的檢測孔位均選擇帶有Target的類型，如上圖。其中將Sample1的類型選為Calibrator即標(biāo)準(zhǔn)樣本，在相對(duì)定量計(jì)算時(shí)，其它樣本均與該標(biāo)準(zhǔn)樣本進(jìn)

30、行比較，以得到基因表達(dá)量更多或更少的數(shù)據(jù)。一般可以將實(shí)驗(yàn)中的空白對(duì)照樣本選為標(biāo)準(zhǔn)樣本，例如用不同的藥物A、B、C處理一批細(xì)胞，其它有一批細(xì)胞是正常培養(yǎng)，沒有處理的，則沒有用藥物處理的細(xì)胞可設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)樣本Calibrator，其它用藥組樣本均與該樣本進(jìn)行比較。而這些處理組的樣本類型均可以選定為Unkown，檢測看家基因的孔位類型選為Reference Unknown，檢測靶基因的孔位類型選為Target Unknown。陰性對(duì)照樣本可根據(jù)其所用引物的不同選定類型為Reference Negative和Target Negative。 在Target Name一欄中填寫檢測的基因名，如以B-acti

31、n作為看家基因的話，在所有看家基因樣本的Target Name一欄均填寫B(tài)-actin；而靶基因以此類推，如上圖。 Efficiency默認(rèn)為2.00。將以上樣本編輯完成后，設(shè)置PCR反應(yīng)程序，即可運(yùn)行儀器，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，可點(diǎn)擊左側(cè)的按鈕，進(jìn)入分析界面，選擇Relative Quantification分析數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊按鈕即可生成相對(duì)定量的數(shù)據(jù)。 注意，如果陰性對(duì)照Negative樣本產(chǎn)生了擴(kuò)增曲線，軟件會(huì)判定該實(shí)驗(yàn)失敗，采用SYBR Green I進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，由于不可避免地產(chǎn)生一些非特異擴(kuò)增和引物二聚體現(xiàn)象，往往會(huì)導(dǎo)致軟件無法計(jì)算出結(jié)果，這個(gè)時(shí)候可以將陰性對(duì)照樣本的類型改為Target Unknown或Reference Unkown來看一下實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果。但出現(xiàn)陰性對(duì)照樣本產(chǎn)生陽性擴(kuò)增曲線的現(xiàn)象時(shí)，一定要進(jìn)行Tm C