Western Blot實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟

1、Western Blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)1、 制膠SDS-PAGE分離膠配方表1、 檢查制膠器是否漏水，吸干玻璃中水分2、 配置分離膠，加入玻璃板中（注意：不能有氣泡和雜物），距離玻璃上口1.5mL停止加膠。3、 再加ddH2O或異丁醇水封除去氣泡，凝膠后倒掉水，吸干水到濃縮膠插梳。2、 上樣1、 先在內(nèi)槽加滿(mǎn)電泳液才可以拔梳子。2、 拔梳子時(shí)垂直向上拔出，不可左右搖晃梳子。3、 拔完梳子后觀察梳子孔，是否有缺口和歪，用針頭撥正。4、 上樣時(shí)從左到右依次上樣。5、 若上樣組不多時(shí)，左右第一孔不加樣。6、 要預(yù)留Marker的上樣孔。3、 電泳4、 轉(zhuǎn)膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylid

2、ene fluoride）是蛋白質(zhì)印跡法中常用的一種固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔徑有大有小，隨著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固。 （ 轉(zhuǎn)膜緩沖液：需4度預(yù)冷，現(xiàn)配現(xiàn)用，不能放太久。）1、 轉(zhuǎn)印濾紙：全膠長(zhǎng)8.5cm，寬5.5cm，需剪裁成7層濾紙，壓平后約3mm。需在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡浸泡備用。2、 海綿墊：在轉(zhuǎn)膜液中平衡浸泡備用。3、 PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸潤(rùn)2min（活化膜上正電基團(tuán)），然后在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡浸泡備用。4、 凝膠：凝膠也需要在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡浸泡35分鐘。否則在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的條帶變形。

3、 三明治夾心法：負(fù)極（黑）-海綿墊-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊-正極（白） 轉(zhuǎn)膜時(shí)間：通電恒流，60V，一個(gè)槽100mA左右，1h （注意：在操作過(guò)程中用玻棒趕走氣泡。 裝置轉(zhuǎn)膜儀時(shí)注意黑對(duì)黑（負(fù)對(duì)負(fù)），白對(duì)紅（正對(duì)正）。 裝置運(yùn)行時(shí)需冰浴。）5、 封閉 在進(jìn)行抗體雜交之前，需要先對(duì)轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行封閉，以防止抗體對(duì)非轉(zhuǎn)印蛋白區(qū)域的非特異性吸附。 封閉一般采用異源性蛋白質(zhì)或去污劑，本實(shí)驗(yàn)室常用的有5%BSA，10%脫脂奶等，至于選擇哪一類(lèi)封閉液，首先應(yīng)考慮與檢測(cè)目的相適應(yīng)（做l酪氨酸磷酸化時(shí)不推薦non-fat milk 封閉）。1、 將脫脂奶粉封閉液（1xTBST:脫脂奶粉=20mL：2g

4、一塊膜用量。牛血清蛋白、5%BSA效果更好）倒好。2、 將PVDF膜取出放入封閉液中，蓋子改好。3、 封膜一般常溫1-2小時(shí)即可，也可4封閉過(guò)夜。6、 一抗抗體反應(yīng)主要采用間接法: 即先加入未標(biāo)記特異性一抗與膜上抗原結(jié)合后，再加入標(biāo)記的二抗進(jìn)行雜交檢測(cè)，標(biāo)記二抗物質(zhì)有放射性核素，酶，以及生物素等。1、 將封閉后的雜交膜，在搖床上用TBST洗膜3次×5min，2、 加入經(jīng)TBST稀釋的一抗（用血清封閉液）3、 4孵育過(guò)夜或室溫?fù)u動(dòng)孵育2-4小時(shí)回收一抗稀釋液7、 洗膜1、之后，在搖床上用TBST洗膜3次×5min，8、 二抗1、 加入標(biāo)記的二抗室溫1-2小時(shí)，二抗不回收注意：

5、一抗稀釋液（稀釋2000到4000）及孵育條件，孵育時(shí)間最好嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)要求來(lái)做。例如：CST某些磷酸化抗體要求5%BSA稀釋液稀釋?zhuān)?平緩震蕩過(guò)夜。根據(jù)不同的目的條件和目標(biāo)抗體，可剪膜后孵育抗體，即便做單一條帶，仍推薦剪膜，在相同體積抗體下，更小的膜可以使抗原和抗體孵育更充分。 回收的一抗可加入疊氮鈉抑菌（-20°保存影響不大）。 二抗作用時(shí)間不可太長(zhǎng)，2小時(shí)之后已無(wú)抗原抗體結(jié)合，導(dǎo)致背景過(guò)深。9、 洗膜1、在搖床上用TBST洗膜3×5min 10、 顯影1、 打開(kāi)電源，預(yù)冷成像系統(tǒng)，同時(shí)開(kāi)機(jī)，打開(kāi)GE成像軟件，等待顯示camera ready。2、 暗室紅燈下操作，按E

6、P管中加顯色劑A、B（4保存）按1：1劑量混勻，ECL發(fā)光液現(xiàn)配現(xiàn)用。  3、 用濾紙吸干PVDF膜上的TBST洗滌液。4、 平整鋪上保鮮膜，5、 將配好的ECL發(fā)光液均勻的涂布于PVDF蛋白膜上，蓋上另一半保鮮膜，放上合適大小的膠片，保鮮膜平整趕走氣泡，關(guān)閉成像儀蓋子，開(kāi)始曝光。6、 曝光時(shí)間：根據(jù)需要，可先曝10-30s，視首曝決定是否再曝，或曝光時(shí)間。7、 曝光后可對(duì)圖像進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過(guò)調(diào)試背景亮度及曝光度。 顯色后strippingStripping solution: 100 mM 2-mercaptoethanol, 2% (w/v) SDS, 62.5 mM T

7、ris-HCl, pH 6.7 方法：將用過(guò)的膜浸入stripping buffer中，置50水浴箱中30min，間斷振搖。之后用TBST洗4*5min就好。 此時(shí)你已經(jīng)可以按新的轉(zhuǎn)移好的膜來(lái)再次使用了。 該方法的優(yōu)點(diǎn)：省事，省力，省錢(qián)。 11、 常見(jiàn)問(wèn)題聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過(guò)程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種：化學(xué)聚合法（常用）和光聚合法。PAGE根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類(lèi)。連續(xù)系統(tǒng)電泳：體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同；帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)：由于緩沖液離子成分、p

8、H、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性；帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率比連續(xù)系統(tǒng)電泳的較好。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。SDS-PAGE各試劑作用1. 過(guò)硫酸銨（APS）為催化劑2. 四甲基乙二胺

9、（TEMED）為加速劑：在聚合過(guò)程中，TEMED催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)3. SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。4. 強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白- SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。5. 聚丙烯酰胺為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直

10、接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液選擇trisHCL系統(tǒng)；AP提供自由基；TEMED催化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進(jìn)行；十二烷基硫酸鈉（SDS）陽(yáng)離子去污劑，作用：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。 配膠緩沖液系統(tǒng)對(duì)電泳的影響？在SDSPAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是TrisHCl緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而Cl離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)

11、。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。所以，pH對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問(wèn)題的情況，應(yīng)首要考慮該因素，當(dāng)然其他的因素也可以從多方面考慮。 樣品如何處理？根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。1）還原SDS處理：在上樣buffe

12、r中加入SDS和DTT（或-巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來(lái)分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過(guò)量的DTT，而防止銀染時(shí)的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測(cè)定

13、分子量來(lái)使用。 SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.8，分離膠選擇pH8.8，選擇TrisHCl系統(tǒng)，TEMED與AP：AP 催化劑，催化單丙和雙丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四甲基乙二胺，催凝劑，加速AP催化作用；十二烷基磺酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。 提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，

14、可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊(cè)P82-103?！?微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。 為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)

15、象？主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過(guò)大引起的。處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，重新配制；降低凝膠濃度。 為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？主要是樣品不溶性顆粒引起的。處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。 什么是“鬼帶”，如何處理？“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過(guò)程中被氧化而失去活性，致使原來(lái)被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反

16、應(yīng)中可見(jiàn)其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來(lái)阻止還原劑的氧化。 為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來(lái)的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。 為什么電泳的條帶很粗？電泳中條帶很粗是常見(jiàn)的事，主要是未濃縮好的原因。處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長(zhǎng)度；保證濃縮膠貯液的pH正確(6.7）；適當(dāng)降低電壓； 為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以

17、下。主要是由于電泳槽沒(méi)有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過(guò)少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。處理辦法：電泳槽正確裝配即可。 濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對(duì)電泳有影響嗎？這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中，一般對(duì)電泳不會(huì)有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過(guò)猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的。 凝膠時(shí)間不對(duì)，或慢或快，怎么回事？通常膠在30MIN-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過(guò)多，此時(shí)膠太

18、硬易裂，電泳時(shí)易燒膠。 電泳時(shí)間比正常要長(zhǎng)？可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級(jí)緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯(cuò)誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強(qiáng)度太高。分離膠加上后為什么要立即加水？加入分離膠后，立即覆一層雙蒸水，一是為了使分離膠界面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質(zhì)分子跑時(shí)在同一水平線(xiàn)上；二是阻止空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的抑制作用。連續(xù)分離膠體系配制（凝膠板厚度0.75mm，長(zhǎng)度10cm）100ml體系：雙蒸水37.5ml尿 素20-50g10×TBE緩沖液8ml30%丙烯酰胺10mlAPS（過(guò)硫酸銨）500-800ul 注：現(xiàn)配現(xiàn)用TEMED（四甲基乙二胺） 23

19、.5ulSDSPAGE電泳的原理及濃縮膠濃縮樣品的原理（甘氨酸的作用） SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是目前最常用的分離蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。下面就SDS-PAGE的基本原理做簡(jiǎn)單介紹。 SDSPAGE電泳的基本原理？ SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS， SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中， 與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白

20、質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為 特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移 速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分 子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它 的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求得分子量。 SDS-PAGE電泳成

21、功的關(guān)鍵是什么？ 溶液中SDS單體的濃度  SDS在水溶液中是以單體和SDS-多肽膠束的混合形式存在，能與蛋白質(zhì)分子結(jié)合的是單體。為了保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為14 或13。 樣品緩沖液的離子強(qiáng)度  因?yàn)镾DS結(jié)合到蛋白質(zhì)上的量?jī)H僅取決于平衡時(shí)SDS單體的濃度，不是總濃度，而只有在低離子強(qiáng)度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度。所 以，SDS電泳的樣品緩沖液離子強(qiáng)度較低，常為10-100 mM。 二硫鍵是否完全被還原  只有二硫鍵被完全還原以后，蛋白

22、質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上從而給出相對(duì)遷移率和分子質(zhì)量對(duì)數(shù)的線(xiàn)性關(guān)系。Sample buffer中的-巰基乙醇的濃度常為4-5%，二硫蘇糖醇的濃度常為2-3%。前者有揮發(fā)性，最好使用前加入。 SDS-PAGE緩沖液系統(tǒng)的選擇，Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸鹽或者其他？ 一般來(lái)說(shuō)，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍，凡是不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對(duì)蛋白帶的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵 的。Tris-甘氨酸系統(tǒng)是目前使用最多的緩沖系統(tǒng)。如果要測(cè)定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-

23、硼酸鹽緩沖系統(tǒng)，對(duì)于分子質(zhì)量小于15 kDa的蛋白樣品，可以使用SDS-尿素系統(tǒng)，也可以采用Tris-tricine緩沖系統(tǒng)。 積層膠（或稱(chēng)濃縮膠）的作用原理？ 在緩沖系統(tǒng)中的弱酸，如甘氨酸，在pH6.7時(shí)很少解離，其有效泳動(dòng)速率很低，而氯離子卻有很高的泳動(dòng)速率，蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速率介于兩者之間。加上電 壓以后，作為先導(dǎo)離子的氯離子和尾隨離子的甘氨酸離子分離開(kāi)來(lái)，并在其后面留下一個(gè)導(dǎo)電性較低的區(qū)帶。由于導(dǎo)電性和電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便獲得較高的 電壓梯度，加速甘氨酸離子的泳動(dòng)，使其趕上氯離子，建立起甘氨酸和氯離子的電壓梯度和泳動(dòng)速率乘積相等的穩(wěn)定

24、態(tài)（我不太明白這句話(huà)），使這些帶電顆粒以相 同的速度泳動(dòng)，兩種離子之間有明顯的邊界。當(dāng)甘氨酸、氯離子界面通過(guò)樣品進(jìn)入濃縮膠時(shí)，在移動(dòng)界面前有一低電壓梯度，界面后有一高電壓梯度。由于在移動(dòng)界 面前的蛋白質(zhì)分子泳動(dòng)速率比氯離子低，因此氯離子能迅速越過(guò)。移動(dòng)界面后的蛋白質(zhì)處于較高的電壓梯度中，其泳動(dòng)速率比甘氨酸快。因此，移動(dòng)的界面將蛋白質(zhì) 分子堆積到一起，形成一條狹窄的區(qū)帶。蛋白質(zhì)在移動(dòng)界面中的濃度作用僅取決于樣品和濃縮膠中Tris-HCl的濃度（為什么？），而與樣品中蛋白質(zhì)的最初 濃度無(wú)關(guān)。由于濃縮膠為大孔凝膠，故對(duì)蛋白樣品沒(méi)有分子篩作用。當(dāng)移動(dòng)的界面到達(dá)濃

25、縮膠和分離膠的界面時(shí)，凝膠的pH明顯增加，導(dǎo)致甘氨酸大量解離。此 時(shí)，甘氨酸的有效泳動(dòng)速率明顯增加，超越蛋白分子，直接在氯離子后移動(dòng)。由于凝膠孔徑變小，蛋白質(zhì)分子的遷移速率降低，落在后面的蛋白質(zhì)便在均一的電壓梯 度和pH環(huán)境中泳動(dòng)，并根據(jù)其固有的電荷與分子大小進(jìn)行分離。 可見(jiàn)，甘氨酸并非作為緩沖成分參與，而是作為尾隨離子來(lái)參與電泳過(guò)程。 以上內(nèi)容主要摘自蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)第二版（郭堯君編著)。需要進(jìn)一步了解相關(guān)內(nèi)容的同學(xué)可以查閱該書(shū)。   SDS-page電泳小問(wèn)答     

26、       Q：SDSPAGE電泳的基本原理？    A：SDS-聚丙烯酰胺 凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉）， SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中， 與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為 特征的負(fù)離子

27、團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移 速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分 子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它 的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求得分子量。       Q：配膠緩沖液系統(tǒng)對(duì)

28、電泳的影響？    A：在SDSPAGE不連續(xù)電 泳中，制膠緩沖液使用的是TrisHCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中， 其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳 動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的 增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率

29、增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn) 行分離。    所以，pH對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問(wèn)題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。       Q：樣品如何處理？    A：根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。    &#

30、160;1、還原SDS處理：在還原劑中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳 中，只根據(jù)分子量來(lái)分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。    2、帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過(guò)量的DTT，而防止銀染時(shí)的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul 20的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。  

31、  3、非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測(cè)定分子量來(lái)使用。       Q：SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？    A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；    制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇trisHCL系統(tǒng)，具體作用后

32、面介紹；    TEMED與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；    十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽(yáng)離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。    Q：提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？    A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝

33、膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。    2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊(cè)P82-103。       Q：“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？    A：主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。    處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。   

34、0;   Q：“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？    A：主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。    處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。       Q：為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？    A：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過(guò)大引起的。    處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，重新配制；降低凝膠濃度。       Q：為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？    A：主要是樣品不溶性顆粒引起的。    處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。 &