使用實時定量 PCR技術(shù)驗證cDNA和差異顯示PCR技術(shù)

1、使用實時定量 PCR技術(shù)驗證cDNA和差異顯示PCR技術(shù)    nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;采用通過監(jiān)測產(chǎn)物積累進(jìn)行的實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（nbsp;RTnbsp;nbsp;PCRnbsp;）可以用來驗證基因表達(dá)的差異。我們在此報道了一種基于nbsp;SYBRnbsp;Greennbsp;Inbsp;染料進(jìn)行的實時nbsp;PCRnbsp;定量方法并通過產(chǎn)物的融解曲          采用通過監(jiān)測產(chǎn)物積累進(jìn)行的實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ RT PCR

2、 ）可以用來驗證基因表達(dá)的差異。我們在此報道了一種基于 SYBR Green I 染料進(jìn)行的實時 PCR 定量方法并通過產(chǎn)物的融解曲線來確定在基因表達(dá)譜方法中確定的基因表達(dá)差異的重復(fù)性。因為 SYBR Green I 染料是一種非特異性的結(jié)合染料，所以反應(yīng)使用了"熱啟動" PCR 以及通過經(jīng)驗性數(shù)據(jù)來確定退火以及檢測產(chǎn)物的溫度。相對的基因表達(dá)水平可以通過使用一系列的 cDNA 濃度做出標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行定量。使用這種方法，實時 PCR 可以確定 DNA 陣列 71% （ 17 21 ）的準(zhǔn)確性，和 91% （ 1 31 ）的差異顯示的準(zhǔn)確性。驗證 DNA 陣列的基因表達(dá)差異與雜

3、交信號的強(qiáng)弱有關(guān)。實時 RT PCR 結(jié)果表明 DNA 表達(dá)差異在 2 4 倍間的差異無法判斷其正確錯誤與否。而差異顯示 PCR 的結(jié)果驗證不依賴于信號的強(qiáng)度。無論是何種基因表達(dá)譜技術(shù)（微陣列， DDPCR ，基因表達(dá)系列分析技術(shù)還是差異雜交技術(shù)），如果已經(jīng)知道目的基因的序列，那么實時 RT PCR 方法就可以適用于驗證這些差異表達(dá)，因為它具有定量功能而且需要的 RNA 量比傳統(tǒng)方法要低 1000 倍。 DNA 陣列（微陣列）和差異 RT PCR 方法是兩種可靠的確證基因表達(dá)和基因組廣泛轉(zhuǎn)錄本差異的方法。這些技術(shù)確定樣本表達(dá)差異的重復(fù)性和敏感性的可靠性受到幾個因素的影響。微陣列的實驗結(jié)果受到陣

4、列產(chǎn)物、 RNA 提取、探針標(biāo)記、雜交溫度條件和圖像分析（ 1 4 ）的影響。 DD PCR 結(jié)果受到電泳分辨率、弱和差異引物、條帶確證和結(jié)合部分的影響。因為這些可靠性上的限制，被確定為差異表達(dá)的基因要經(jīng)過另一種方法的檢測。 Northern 雜交或者 RNA 酶保護(hù)分析都是有效的但是至少要 5mg 的 RNA 。傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ RT DDPCR ）要求的 RNA 要少一些，但其終點分析缺乏定量上的精確性（ 6 8 ）。實時 RT PCR 技術(shù)方法是當(dāng)前最新的確定基因表達(dá)的方法，在這篇報道中，我們詳細(xì)描述了使用實時 PCR 技術(shù)和其與 DNA 陣列以及 DD PCR 技術(shù)的相互結(jié)

5、合，來驗證基因表達(dá)的正確性。 方法描述 : 基本策略 為了滿足驗證表達(dá)譜研究確定的大量基因，我們研究了實時定量 PCR 系統(tǒng)并使用 SYBR Green I 染料。此外，還用每個基因的一系列已知濃度的模板制作了絕對定量曲線，以相對比較不同的樣本。相對定量曲線只需要使用在表達(dá)譜研究中確定的一個高表達(dá)樣本中獲得的 cDNA 的一系列稀釋度制作完成。 盡管仍然需要設(shè)計基因特異性的引物，但不需要設(shè)計內(nèi)在的基因特異性的熒光探針。此外，反應(yīng)的特異性由產(chǎn)物的 Tm 值確定（ Tm ： DNA 雙螺旋一半解鏈時的溫度）。反應(yīng)的特異性由"熱啟動" PCR 得到提高，并在低于產(chǎn)物 Tm 值 1

6、 2 時獲得信息。這樣就可以避免由通常來說 Tm 值較低的引物二聚體引起的非特異性信號（ 10 ）。 實時 PCR的反應(yīng)條件 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件 使用在基因表達(dá)譜分析中采用的總 RNA 進(jìn)行驗證實驗。采用 SuperScript First Strand Synthesis System 進(jìn)行 RT-PCR （ Invitrogen, Carlsbad, CA) ）反應(yīng)來合成 cDNA ，反應(yīng)體系為 20ul ，里面包含 1 m gDNaseI 處理過的總 RNA ， 20 mM TrisHCl (pH 8.4) ， 50mMKCl ， 2.5mMMgCl2 ， 10mMdithiothreito

7、l (DTT) ， 0.5 m g oligo(dT)1218, dNTP （各 0.5mM dATP, dGTP, dCTP, 和 dTTP ） 以及 200 U SuperScript II Reverse Transcriptase ?；旌辖M分時，先混合 RNA 和 oligo(dT) ， 70 保溫 10 分鐘，再放到冰上并加入剩余的反應(yīng)組分。反應(yīng)在 42 孵育 1 小時，然后再 70 加熱 15 分鐘終止反應(yīng)。 cDNA 再加入 2 U 的 RNase H (Invitrogen) 37 孵育 20 分鐘，再在 70 加熱 15 分鐘終止反應(yīng)。此外用一個沒有逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)來驗證是否有

8、基因組 DNA 的污染（無 RT 對照）。 cDNA 在使用前放置在 20 保存。進(jìn)行實時定量 PCR 前不需要進(jìn)行 cDNA 的純化。 確定實時定量 PCR 的反應(yīng)條件 使用 GENSET OLIGOS, Oligo Version 4, (GENSET Corp., La Jolla, CA) 或者 LASERGENE 的 PRIMERSELECT 軟件 (DNASTAR, Inc., Madison, WI) 計算產(chǎn)物的 Tm 值來確定反應(yīng)的退火溫度。摸索退火溫度時，每次以計算得到的 Tm 值增加或減少 2 3 ，直到其與引物二聚體和非特異性產(chǎn)物間有 3 5 的差別。信息采集時候的溫度可

9、以設(shè)置到特異性產(chǎn)物的 Tm 值以下 1 2 ，以減少非特異性產(chǎn)物的干擾。 反應(yīng)步驟和循環(huán)條件 所有的步驟按照儀器的使用說明進(jìn)行。按照試劑說明將包含有 Tag DNA 聚合酶， dNTP, MgCl2, 和 SYBR Green I 染料的 DNA Master SYBR Green I 混合液與 0.16 m l TaqStart Antibody (Clontech,Palo Alto, CA) 混合一起室溫孵育 5 分鐘，然后再加入引物和 cDNA 模板。除此外，每個反應(yīng)（ 20ul ）中包含 2ul 的 cDNA ， 0.4 m M 的引物和 4 m MMgCl2 。使用 1:200 和

10、 1:2000 稀釋的 cDNA ，但分析極微量的信息時要求更少的 cDNA 稀釋度。每個稀釋度進(jìn)行一個重復(fù)實驗，同時用一個無模板的陰性對照，這些優(yōu)化實驗不用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)條件包括 95 先孵育 60 秒預(yù)變性和熱啟動，然后再進(jìn)行 50 個循環(huán)，過程按優(yōu)化好的實驗結(jié)果進(jìn)行。并最終通過儀器進(jìn)行一個融解曲線分析。 驗證實驗 實驗條件 通過實驗確定退火溫度和信號讀取溫度后，就可以設(shè)置樣品的相對基因表達(dá)反應(yīng)了。 PCR 的反應(yīng)條件按上述進(jìn)行。相對定量曲線用兩個重復(fù)的預(yù)測具有最高表達(dá)水平的樣品的一系列 cDNA 的稀釋度（ 1 ： 200,1 ： 2000 和 1 ： 20000 ）進(jìn)行。并人為地將其

11、數(shù)值定為 0.5 、 0.05 和 0.005 。未知模板的的 cDNA 稀釋 200 倍。每個基因都做一個無模板的對照，非 RT-PCR 對照只用一對引物來確定是否有基因組 DNA 的污染。引物為 G3PDH 的引物，并同所有的稀釋為 1 ： 200 的無 RT 模板進(jìn)行比較。 反應(yīng)溫度也同上進(jìn)行熱啟動過程并按照反應(yīng)條件進(jìn)行，同時也做融解曲線分析。為了使結(jié)果可信，至少三個定量稀釋度中的二個必須特異性的反應(yīng)（以 Tm 值為交準(zhǔn)），而無模板對照在比信號讀取溫度低的時候必須沒有產(chǎn)物和引物二聚體。如果只有一個稀釋度產(chǎn)生了特異性產(chǎn)物，那么則需要重新調(diào)整稀釋度來保證至少標(biāo)準(zhǔn)曲線上有兩個可應(yīng)用的點，如果引

12、物二聚體影響了讀板溫度，就應(yīng)該調(diào)整反應(yīng)溫度。如果無 RT 對照通過融解曲線分析發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)物存在，則應(yīng)用 DNA 酶 I 來消除 DNA 污染。 計算 每組反應(yīng)都用隨機(jī)的軟件進(jìn)行分析，并按照軟件的操作手冊進(jìn)行。簡單地來說，就要設(shè)定好域值線消除掉無信息的熒光背景信號，標(biāo)準(zhǔn)曲線由儀器自動按照設(shè)定好的值生成。軟件能為每個反應(yīng)自動計算最終的濃度。并最終得到樣本的濃度和相關(guān)系數(shù)。 使用實時 PCR技術(shù)驗證基因表達(dá): 當(dāng)待檢基因序列已知時可以用上述描述的定量 RT PCR 的方法來驗證不同基因表達(dá)方法（ cDNA 陣列， DD PCR ，基因表達(dá)系列分析以及雜交）得到的結(jié)果。這里描述的是用實時定量 PCR 技

13、術(shù)來檢測與微陣列與 DD PCR 方法得到的結(jié)果。詳細(xì)的步驟在圖 1 中進(jìn)行了描述。 驗證 DNA陣列結(jié)果 可用以上述描述的方法來驗證任何陣列平臺（ cDNA 或寡核苷酸）得到的基因表達(dá)差異。例如，我們使用采用基于 cDNA 的高密度陣列（ Atlas Human Cancer cDNA Expression Array; Clon-tech ）來研究 W12 腦上皮細(xì)胞的兩個亞克隆 (20863 和 20861) 采用 HPV16 處理不同狀態(tài)時的基因表達(dá)差異（ 9 ）。用于驗證的基因基于其雜交的熒光強(qiáng)度（亞克隆 20863 作為參考）和相對熒光強(qiáng)度（亞克隆 20863 與亞克隆 20861

14、 ）。 基因特異性引物來驗證陣列結(jié)果 對于 Clontech 陣列來說，可以從制造商處獲得基因特異性引物的信息。在本例中，需要的只是合成引物。如果沒有此信息，可以設(shè)計基因特異性的引物（使用從 GenBank 中得到的序列信息）以用于驗證結(jié)果。引物應(yīng)當(dāng)為 1724 個堿基長，產(chǎn)物大小為 150650bp 。產(chǎn)物太大的話不適用用于定量擴(kuò)增。避免基因家族的保守性區(qū)域可以得到更好的特異性結(jié)果。 實時 RT-PCR 與 DNA 陣列結(jié)果的比較 G3PDH 是在大多數(shù)細(xì)胞中表達(dá)的含量豐富的看家基因，但在某些條件下的表達(dá)發(fā)生改變（ 11 ），通過 DNA 陣列雜交發(fā)現(xiàn)， G3PDH 的轉(zhuǎn)錄本在亞克隆 208

15、63 和 20861 中的表達(dá)相同。實時定量 RT-PCR 也發(fā)現(xiàn)在兩個亞克隆中有著相同的轉(zhuǎn)錄水平 (9) ，實時 PCR 的忠實性可以由無 RT 和加水的對照以及每個基因的 CV 值得到證明。每個高強(qiáng)度雜交的基因平均的 CV 值為 12%( 范圍： 1-25%) ，而對于低雜交強(qiáng)度的基因來說則為 18%( 范圍： 18-28%) 。 表 1 計算相對表達(dá)水平以及變異系數(shù)    組 1    0.447    0.0285    0.5

16、59    0.0226    平均值    0.503    0.0255    組內(nèi) CV    15.7%    16.32%    組 2    0.556    0.0203 &#

17、160;  0.45    0.0298    平均值    0.503    0.0250    組內(nèi) CV    14.9%    26.8%    組平均值    0.503   &#

18、160;0.025    組間 CV    15.32%    21.57%    相對表達(dá)水平（樣品 1 樣品 2 ） 0.503 0.525 20 倍 變異系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值 100 變異系數(shù)的值由 RT PCR 的結(jié)果決定    . cDNA 和實時 PCR 得到的基因表達(dá)結(jié)果的變化在表 2 中， 實時 PCR 的結(jié)果表明了當(dāng)雜交信號較高時大多數(shù)的 cDNA 差異結(jié)果 (88% ， 15 1

19、7) 或者是在不同亞克隆間表達(dá)水平的差異可以達(dá)到 4 倍的基因得到了確定 (5 5) 。而在低強(qiáng)度雜交的樣本中只有一個得到了確定 (1 4) ?？偟膩碚f，實時定量 PCR 確定了 81%(17 24) 的基因。 cDNA 陣列和實時 PCR 得到基因表達(dá)量上的差異也有差別。例如，在 14 個由實時 PCR 驗證的基因中，有 10 個表達(dá)的差異水平要超過由 cDNA 陣列確定的表達(dá)水平。 驗證 DD-PCR結(jié)果 DD-PCR 條帶的選擇和基因特異性引物 DNA 陣列和 DD-PCR 技術(shù)間主要的差別在于 DD-PCR 條帶上并沒有序列信息。因此，驗證的第一步就是要從 DD-PCR 結(jié)果膠中切下目

20、的條帶并從中回收 DNA 。切下選擇的條帶按照熒光 DD-PCR 手冊 (Beckman and Coulter, Inc., Foster City,CA) 進(jìn)行， PCR 得到的反應(yīng)結(jié)果按照 DD-PCR 的條件進(jìn)行重新擴(kuò)增，經(jīng)凝膠回收后再進(jìn)行測序。將測序結(jié)果中未知序列小于 10% 的條帶用于驗證反應(yīng)。包含有混合序列的條帶不適用于用于驗證反應(yīng)，除非能確定主要序列。確定好序列后，就需要設(shè)計引物來進(jìn)行上述的反應(yīng)。 實時 PCR 和 DD-PCR 結(jié)果的比較 s 在本例中，使用優(yōu)化的熒光 DD-PCR 系統(tǒng) (Beckman Coulter, Inc.) 來驗證未分化的單層細(xì)胞與亞克隆 2086

21、1 基因表達(dá)的差異。按照熒光強(qiáng)度的不同，將條帶相對的表達(dá)水平分為 2-4 倍， 5-10 倍和大于 10 倍。根據(jù)絕對的熒光值將條帶分為弱、中等和強(qiáng)三類。（表 3 ）。 條帶 I 設(shè)計的引物得到的 . 擴(kuò)增結(jié)果在所有的 cDNA 稀釋度中均有重疊。這表明了條帶 I 在單層細(xì)胞與亞克隆中有著相同的表達(dá)， DD PCR 和實時 PCR 得到的結(jié)果有一致的。不同稀釋度得到的融解曲線（結(jié)果未顯示）表明設(shè)計的引物均得到了特異性的結(jié)果，實時 PCR 用來驗證了全部的 13 條差異片段。弱及中等強(qiáng)度信號條帶的 CV 值為 10.4% （ 3 28.5 ）。而對于強(qiáng)信號的條帶來說則為 18% （范圍： 0.8

22、% ）。實時 PCR 驗證了除了一個外，全部的（ 1 13,92% ）的 DD PCR 結(jié)果代表了一個已知基因或 EST 。而且不同信號強(qiáng)度的代表了不同相對表達(dá)水平。    技術(shù)細(xì)節(jié) :   RNA 質(zhì)量是所有基因表達(dá)分析中最重要的變數(shù)。商業(yè)化的 RNA 提取試劑盒可以得到極好的純度和無降解的 RNA ，這可以適用于酶的反應(yīng)以及基因表達(dá)分析的檢測系統(tǒng)。 RNA 的完整性應(yīng)當(dāng)在長時間的保存過程中得到保證，因為基因表達(dá)譜分析有時候只能在 RNA 提取的數(shù)周或數(shù)月后才能進(jìn)行?？?RNA 應(yīng)該用 DNase I (0.4 u/ m g RNA) 按照試

23、劑盒的要求進(jìn)行處理。 RNA 用 UV 分光光度計進(jìn)行定量，并用甲醛的瓊脂糖電流來檢測降解程度（ 12 ）。 2 如果 RNA 的量有限 (10 m g) ，有另一種方法可以替代 DNase I 處理（ 13 ）。方法是在 RT 反應(yīng)中加入逆轉(zhuǎn)錄酶之前先用 DNase I 來處理 RNA ，以避免由酚氯仿抽提時造成的 RNA 的損失。我們在實時 RT PCR 實驗中驗證了用 DNase I 處理有限 RNA 樣品的效果，非常令人滿意。 3. 如果實驗樣品 RNA 有限，可以用較易獲得的同一種基因型（人的來自 cDNA 的 RNA 或是來自鼠 cDNA 的鼠 RNA ）的 RNA 用于確定最優(yōu)化

24、的退火和信號讀取溫度。但是，從這些資源得到的 RNA 應(yīng)該按照樣品處理的方法進(jìn)行同樣的處理，因為 Tm 值會受到殘留鹽和其它方法的影響。 4. 有些引物對也許會在不同的引物退火溫度和加熱時間的情況下產(chǎn)生幾個峰的融解曲線。這也許表明引物存在非特異性或者是表達(dá)存在不同的剪接轉(zhuǎn)錄本或者發(fā)現(xiàn)有新的基因家族成員。在這種情況下可以把反應(yīng)樣品從反應(yīng)管中取出進(jìn)行凝膠電泳并進(jìn)行產(chǎn)物測序。 結(jié)論 : 采用熱啟動 PCR 和在特異產(chǎn)物 Tm 值以上進(jìn)行熒光信號讀取可以使基于 SYBR Green I 染料的實時 PCR 變得敏感而特異（ 10 ）。這里描述的技術(shù)可以使 cDNA 陣列中高和低強(qiáng)度雜交信號和 DD P

25、CR 中低到高強(qiáng)度信號的每個基因的 CV 值為 15% 。平均 CV 值低于通常報道的 25 25% 。大部分通過 cDNA 陣列和 DD PCR 方法得到的差異基因可以通過實時 PCR 技術(shù)得到確證（采用 1 ： 200 到 1 ： 20000 的 cDNA 稀釋， 20ul 反應(yīng)體系中加入 1ul 的模板 RNA ）。因為實時 PCR 方法可以采用極低量的 cDNA ，驗證由高通量方法得到的 100 1000 個基因只需要 1 m g 的總 RNA 。如采用 Northern 雜交或 RNase 保護(hù)方法進(jìn)行驗證，則至少需要 5 m g 的總 RNA ，這接近于采用實時 PCR 反應(yīng)分析的

26、 5000 倍。 實時 PCR 技術(shù)驗證的不同表達(dá)強(qiáng)度信號的 DD PCR 條帶表明了對 DD PCR 條帶的驗證并不依賴于條帶的信號強(qiáng)弱。另一方面，雜交信號的強(qiáng)弱和基因的相對表達(dá)水平對 cDNA 陣列結(jié)果的影響也得到了驗證。與采用的篩選技術(shù)相比，實時 PCR 得到的結(jié)果在基因表達(dá)水平上有很大的不同。這種不同也許是由于采用篩選技術(shù)和 DD PCR 技術(shù)時沒有辦法采用特異性的引物來區(qū)分同一個基因家族。除非 DNA 陣列技術(shù)采用了針對序列特異轉(zhuǎn)錄本的優(yōu)化，否則 cDNA 陣列雜交結(jié)果就有可能被交叉雜交或重復(fù)制的基因家族成員所遮蓋。簡單的，為 DD PCR 條帶設(shè)計特異性的引物也受到序列信息不足和新

27、的轉(zhuǎn)錄本的限制。實時 PCR 方法作為一種輔助的驗證方法，有可能成為只使用少量 RNA 的情況下，定量大量已知和新基因表達(dá)變化的快速的新途徑。 參考文獻(xiàn)   Der, S. D., Zhou, A., Williams, B. R. G., and Silverman, R. H.(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1562315628.   Eisen, M., and Brown, P. O. (1999) Methods Enzymol. 303, 179205.   Winzeler, E. A., Schena, M., and Davis, R. W. (1999) MethodsEnzymol. 306, 319.   Schuchhardt, J., Beule, D., Malik, A., Wolski, E., Lehrach, H.,and Herzel, H. (2000) Nucleic Acids Res. 28 (10), E47.   Poirier, G. M. C., and Erlander, M. G. (1998) Methods 16,