健康食品之促進(jìn)鐵吸收功能評估方法

1、健康食品之促進(jìn)鐵吸收功能評估方法衛(wèi)署食字第0950405557號公告附件一、背景明(1-16)根據(jù)合國農(nóng)組織與世界衛(wèi)生組織 (FAO/WHO) 之報告，缺鐵仍是可忽視的營養(yǎng)缺乏問題之一，除盛於經(jīng)濟(jì)後與開發(fā)中國家之外，在經(jīng)濟(jì)富裕之歐美先進(jìn)國家也沒有完全解決。缺鐵的定義是體內(nèi)鐵儲存耗竭，並且增加貧血的危險，而貧血是缺鐵末期的癥。美國自1943開始強(qiáng)制實麵粉營養(yǎng)強(qiáng)化措施，添加的營養(yǎng)素包括維生素B1、B2、菸鹼素與鐵，然而根據(jù)美國最新之健康調(diào)查NHANES III (1988-1994)，美國缺鐵盛以生育齡性有9-11%最高，其次是1-2歲幼兒9%，50歲以上性也有5-7%之多，男性缺鐵則低於2%。瑞

2、典之調(diào)查指出其青少之缺鐵盛超過15%，性甚至高達(dá)40%。我國第一次國民營養(yǎng)健康況變遷調(diào)查同時用血鐵蛋白濃、運鐵蛋白飽和和血紅素濃等血液指標(biāo)評估鐵營養(yǎng)況。四歲以上國人之總?cè)辫F為男性2.1%，性10.7%鐵儲存耗盡之比為男性1.3%，性7.7%缺鐵貧血為男性0.2%，性2.1%國人缺鐵問題與歐美國家同，是以無床癥之缺鐵為主，並且有明顯的性別差，以性較男性為嚴(yán)重。除65歲以上人性之缺鐵均高之外，男性缺鐵最高的是13-18歲，與青春期之快速成長有關(guān)性則從13-64歲有9%以上之缺鐵，以30-50歲有14.2%最高，快速成長與月經(jīng)有重要的影響，另外因體重控制而減少攝食或食物選用當(dāng)，也可能增加缺鐵之危險。

3、缺鐵為一漸進(jìn)而續(xù)的變化過程，初期為體內(nèi)儲存之鐵耗盡，進(jìn)而使血液中運送之鐵短缺，逐漸敷造血組織之需要，最後導(dǎo)致血紅素之合成足，而造成貧血癥。因此，缺鐵可分為無貧血性缺鐵與缺鐵性貧血大。貧血發(fā)生之前，通常沒有明顯辨之癥。貧血發(fā)生之後，多種生機(jī)能之癥就明顯可辨，如肌肉動效明顯低，無法從事劇短促的活動，影響肌肉的生和能代謝效，增加心臟的負(fù)荷等。缺鐵貧血與嬰幼兒性運動能有關(guān)，並且有為常的現(xiàn)象，使心智發(fā)展明顯較差，包括語言能差，運動協(xié)調(diào)與平衡佳，注意、反應(yīng)敏與情緒的分均明顯較低，甚至有長期的影響，因為長期追蹤發(fā)現(xiàn)，缺鐵貧血幼兒於五或十後其認(rèn)知能與學(xué)習(xí)成就仍然較為低。無貧血性缺鐵也會低認(rèn)知能，缺鐵之高中生經(jīng)

4、過鐵補(bǔ)充之後，可以提升其語言學(xué)習(xí)與記憶能。美國NHANES III調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，6-16歲兒童青少中，缺鐵者的學(xué)得分顯著較健康者為低，風(fēng)險比 (odds ratio) 高達(dá)2.3。富裕社會中無貧血性缺鐵盛仍然居高，由於涉及學(xué)習(xí)發(fā)展，故對兒童青少的鐵營養(yǎng)況必須密注意。缺鐵影響免疫機(jī)能，根據(jù)人體與動物實驗證實，缺鐵主要影響項免疫功能中性白血球吞噬細(xì)菌能低，T巴細(xì)胞對細(xì)胞增生劑或抗原的反應(yīng)低。缺鐵還會增加鉛中毒的危險，美國兒童中缺鐵者鉛中毒的比較健康者高出34倍。因為缺鐵時小腸負(fù)責(zé)鐵吸收的蛋白質(zhì)DMT1表現(xiàn)增加，但是它缺乏專一性，故對其他二價屬元素，包括鉛、鉻等重屬的吸收也伴隨增高。 國人缺鐵問題仍然

5、存在，我國並未全面實食物加鐵強(qiáng)化之措施，因為缺鐵問題有個人之差，並非人人需要補(bǔ)鐵，而且體內(nèi)鐵儲存大幅增加並增添處。因此發(fā)展各種補(bǔ)鐵食品以供消費者依個人需要選用，配合個人日常飲食以維護(hù)鐵營養(yǎng)之充足，有其積極正面之意義。已知影響鐵吸收的主要因素有鐵的化學(xué)形式與鐵可用 (bioavailability)。鐵的化學(xué)形式主要區(qū)分為血鐵質(zhì)heme iron與非血鐵質(zhì)non-heme iron種。血鐵質(zhì)主要自肉，其吸收受其他飲食成分的影響，但是受鐵營養(yǎng)況之調(diào)節(jié)，吸收平均25%，缺鐵時可提高到40%，鐵充足時可到10%。長時間高溫烹調(diào)會使血鐵質(zhì)分解成非血鐵質(zhì)。非鐵血質(zhì)自各種植物性食品，鐵蛋白 (ferriti

6、n) 以及鐵補(bǔ)充劑等等，其吸收平均約7.5%，缺鐵時可提高到21%，鐵充足時會為2.5%。飲食成分會影響非血鐵質(zhì)的吸收，促進(jìn)吸收的成分主要有維生素C和禽畜魚等肉，維生素C含在25-100 mg之間與鐵吸收有正比關(guān)係，增高劑並無進(jìn)一步的效。肉包括禽、畜、魚貝等動物之肌肉蛋白質(zhì)，其消化分解之小分子產(chǎn)物可以與鐵形成可溶性錯合物以增加鐵的溶解而促進(jìn)吸收。西式乳酸發(fā)酵之蔬菜、發(fā)酵黃豆製品也有促進(jìn)鐵吸收的效。由於飲食鐵質(zhì)之吸收並完全，故以鐵可用代表食物或飲食中可被人體正常消化、吸收並供生用的鐵，這是綜合個生過程的結(jié)果，這些過程大致上可分為三個步驟：（1）消化，（2）小腸細(xì)胞攝入鐵（iron uptake）

7、與血液運輸，及（3）形成功能性蛋白質(zhì)以執(zhí)生功能。因此，測上述過程可以反映鐵可用。二、鐵可用評估原(4, 15, 16)目前食物鐵可用的評估方法分為體外（in vitro）測法、動物實驗法與人體實驗法三種。體外測法有體外消化透析法（in vitro digestion and dialysis）與體外消化Caco-2細(xì)胞攝鐵法 (in vitro/Caco-2 cell culture model)。體外消化透析法是根據(jù)可溶性、小分子鐵錯合物才可能被人體吸收的原，採用模擬胃腸消化作用之條件，將食物消化分解後，用透析膜分小分子含鐵成分，稱為可透析鐵dialyzable iron，測其比以間接代表鐵

8、可用，所得之結(jié)果與人體鐵吸收顯著相關(guān)。體外消化Caco-2細(xì)胞攝鐵法除用模擬胃腸消化作用之條件與透析膜分小分子含鐵成分之外，加上細(xì)胞模式以模擬小腸之吸收作用，吸收之鐵可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白之生合成，者有正相關(guān)性，故以鐵蛋白間接代表鐵可用。Caco-2細(xì)胞源自人大腸腺細(xì)胞瘤（colon adeno-carcinoma），會自發(fā)性分化，並擁有許多小腸細(xì)胞的特性，包括極化（polarization）的型態(tài)、形成微絨毛（microvilli）與tight junction，細(xì)胞內(nèi)有儲鐵用之鐵蛋白，並且具有與鐵吸收相關(guān)的DMT1、HFE等各種蛋白質(zhì)，多種促進(jìn)或抑制鐵吸收之成分可影響其攝鐵作用，與小腸之反應(yīng)相

9、似。在美國國家衛(wèi)生院NIH the Office of Dietary Supplements與the American Society ofNutritional Sciences 的研討會中，此法被認(rèn)為具有高的應(yīng)用價值，所測得之結(jié)果與人體鐵吸收顯著相關(guān)。動物實驗法採用最為普遍的是AOAC (Association of Official Analytical Chemists) 建議之大鼠血紅素再生法 (rat hemoglobin repletion bioassay)。其原是用缺鐵貧血大鼠對食物鐵質(zhì)有最大的吸收能，並且優(yōu)先用於合成血紅素，故以含鐵食物或化合物後，追蹤其血紅素濃之增加，可

10、以反映食物之鐵可用，可用區(qū)別同鐵源的用效。此法屬於終點endpoint測法，符合鐵可用的定義。國際營養(yǎng)性貧血顧問小組 (International Nutritional Anemia Consultative Groups) 曾經(jīng)比較AOAC法與人體試驗測得之鐵可用，發(fā)現(xiàn)者顯著相關(guān)，可作為人體鐵可用之考。動物實驗法之主要限制是適合評估促進(jìn)鐵吸收之成分，因為缺鐵貧血大鼠的鐵吸收很高，足以掩飾其他促進(jìn)因子的效應(yīng)。AOAC法自1974建以並無任何修訂版本，然而隨著動物實驗技術(shù)之進(jìn)步，以及鐵吸收機(jī)制之新知，其基礎(chǔ)配方已適用，修訂之配方（表一）及條件應(yīng)考蕭氏之政院衛(wèi)生署委託計畫研究報告改並建我國保健食

11、品補(bǔ)鐵機(jī)能評估的檢測方法(36)。人體實驗法可以直接反映食品之鐵可用，是補(bǔ)鐵功能的最佳指標(biāo)。雖然鐵之吸收用可以放射性同位素鐵追蹤定，但此等方法在國內(nèi)難以執(zhí)。可的方法是以缺鐵貧血者為試驗對象之血紅素增生法，提供促進(jìn)鐵吸收健康食品，使其依照食品使用明服用，定期追蹤血紅素等鐵營養(yǎng)相關(guān)指標(biāo)之增加，據(jù)以評估鐵可用。人體對鐵之吸收用有其恆定調(diào)控機(jī)制，健康食品可以經(jīng)由改變鐵之形式，提供促進(jìn)鐵吸收之成分或去除抑制鐵吸收之成分等策以提高食品之鐵可用。因此健康食品促進(jìn)鐵吸收功效可以依產(chǎn)品特性採用同評估方法（表一）。實驗結(jié)果符合下三項標(biāo)準(zhǔn)之一，即可評定為具有促進(jìn)鐵吸收之功能：1. 人體實驗結(jié)果獲得顯著的促進(jìn)效應(yīng)2.

12、 體外消化Caco-2細(xì)胞攝鐵實驗或大鼠血紅素再生實驗獲得顯著的促進(jìn)效應(yīng)3. 體外消化透析法配合體外消化Caco-2細(xì)胞攝鐵實驗，或體外消化透析法配合動物實驗獲得顯著的促進(jìn)效應(yīng)。表一、促進(jìn)鐵吸收之產(chǎn)品策與適用之評估方法產(chǎn)品策 適用之評估方法改變鐵之形式 人體試驗2. 大鼠血紅素再生法3. 體外消化Caco-2細(xì)胞攝鐵法4. 體外消化透析法體外消化Caco-2細(xì)胞攝鐵法5. 體外消化透析法大鼠血紅素再生法提供促進(jìn)鐵吸收之成分 人體試驗2. 體外消化Caco-2細(xì)胞攝鐵法3. 體外消化透析法Caco-2細(xì)胞實驗去除抑制鐵吸收之成分 人體試驗2. 大鼠血紅素再生法3. 體外消化Caco-2細(xì)胞攝鐵法

13、4. 體外消化透析法Caco-2細(xì)胞攝鐵法5. 體外消化透析法大鼠血紅素再生法三、評估方法與步驟（一）體外消化透析法（in vitro digestion and dialysis）：簡稱透析法(17-21)1. 儀器設(shè)備食物研磨機(jī)、pH 測定儀（pH meter）、控溫震盪培養(yǎng)箱或控溫震盪水浴槽（shaker incubator）、原子吸收光譜儀（atomic absorption photometer）、分光光計（spectrophotometer）。2. 主要器材透析膜MWCO 6,0008,000 (Spectra/Por)，使用之前以去子水浸泡12小時；有蓋高型玻璃燒杯，容100-1

14、50 mL；透析膜夾等。實驗用玻璃器皿均應(yīng)以酸液浸泡，經(jīng)去子水沖淨(jìng)，去除鐵之污染後方可使用。3. 藥品與試劑胃蛋白酶（pepsin）：porcine，活性800-2500 units/mg protein。胰臟酵素 (pancreatin)：porcine，活性4 x U. S. P. specifications。膽汁萃取物 (bile extract)：glycine and taurine conjugates of hyodeoxycholicand other bile salts。各種酸鹼試劑與藥品必須無微礦物質(zhì)污染，包括：HCl、NaHCO3、trichloroacetic ac

15、id (TCA)、hydroxylamine hydrochloride、sodiumacetate、bathophenanthroline disulfonate、原子吸光分析用鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液等。胃蛋白酶溶液（pepsin solution），簡稱胃液每100 mL的0.1 N HCl溶液中含2.5-5 g胃蛋白酶，加入子交換樹脂 (Chelex-100) 2.5-5 g，室溫震盪反應(yīng)30分鐘，心或過移除樹脂以去除試劑中之鐵後，置於玻璃血清瓶中，儲存於4下，於一星期之內(nèi)使用。胰液膽鹽懸浮液（pancreatin-bile suspension），簡稱胰液每100 mL的0.1 M NaHCO3溶

16、液中含0.2-0.4 g 胰臟酵素及1.2-2.5 g膽汁萃取物，加入子交換樹脂 (Chelex-100) 15 g，室溫震盪反應(yīng)30分鐘，心或過移除樹脂以去除試劑中之鐵後，置於玻璃血清瓶中，儲存於4下，於一星期之內(nèi)使用。還原劑溶液於250 mL去子水中溶解100 g hydroxylamine hydrochloride，加入子交換樹脂 (Chelex-100) 2-5 g，室溫震盪反應(yīng)30分鐘，心或過移除樹脂以去除試劑中之鐵後，置於玻璃血清瓶中備用。蛋白質(zhì)沉澱劑100 g TCA以去子水定容至500 mL，嚴(yán)防鐵污染。鐵呈色劑，可透析鐵定分析之用，組成分為：250 mg bathophen

17、anthroline disulfonate先溶於50 mL 去子水，再加入250 mL還原劑溶液及4M Na-acetate溶液500 mL，最後以去子水定容至1L。鐵對照溶液以FeSO4 溶於0.01 N HCl，適用的濃為10-100 M，實驗時選用與測試樣品相當(dāng)之濃，使用時新鮮配製。4. 實驗方法及步驟每次實驗應(yīng)包含以下組別：（1） 控制組：鐵對照溶液或其與含健康食品之基礎(chǔ)飲食的組合，含鐵與實驗組相當(dāng)，除含健康食品之外，基礎(chǔ)飲食之組成與特性應(yīng)與實驗組相近。（2） 正對照組：鐵對照溶液或其與含健康食品之基礎(chǔ)飲食的組合，含鐵與實驗組相當(dāng)，除含健康食品之外，基礎(chǔ)飲食之組成與特性應(yīng)與實驗組相近

18、，另外加入ascorbic acid，使莫耳比ascorbate：Fe = 20：1。（3） 實驗組：健康食品或含健康食品之飲食，鐵與控制組相當(dāng)。健康食品添加含鐵成分，應(yīng)符合我國食品衛(wèi)生管法、食品添加物使用範(fàn)圍與用標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)法規(guī)。每次實驗各種處至少應(yīng)有二重複，每個實驗至少重複次。體外法必須小心控制的條件是pH值、酵素活性與反應(yīng)時間，圖一為透析法的實驗程。測試樣品為液態(tài)則可直接使用，為固型物則需加入適去子水，以研磨機(jī)將樣品均質(zhì)成乳樣品漿，紀(jì)樣品與水之比與重。 模擬胃液消化反應(yīng) 樣品液或樣品漿以6N HCl調(diào)為pH 2，每100 g樣品液加入5 mL胃蛋白酶溶液，於37下震盪反應(yīng)2小時而得胃消化物

19、，取20 g 供酸滴定之用，其餘暫時冰凍保存以待下一步模擬小腸消化反應(yīng)與鐵定之用。 酸滴定 目的是定胃消化物加上胰液後，欲使混合物酸鹼達(dá)到小腸環(huán)境之pH 7.5，所需之KOH當(dāng)。對20g的胃消化物加入5 mL的胰液，混合均勻後，以0.5N KOH滴定至pH 7.5，紀(jì)所需KOH當(dāng)，換算為NaHCO3。 模擬小腸消化反應(yīng) 準(zhǔn)備透析袋，用酸滴定結(jié)果，將中和所需之NaHCO3溶於25 mL去子水，裝入透析袋中，袋口夾緊毋使?jié)B以備用。將冰凍之胃消化物解凍，以20 g為單位秤取分裝，分別置於100 ml燒杯中，然後將透析袋置入燒杯中，加蓋，於37下震盪反應(yīng)30分鐘，使鹼升高到pH 5，然後加入5 mL

20、胰液，繼續(xù)反應(yīng)2小時。結(jié)束時，取出透析袋，以去子水和緩地沖洗其外部以去除消化物之干擾後，倒出袋中透析液，收集於塑膠心管或玻璃瓶中，紀(jì)體積後，供可透析鐵之定分析。5. 分析項目與方法 樣品總鐵分析 剩餘胃消化物秤取適，經(jīng)灰化處後，灰份以濃HCl溶解完全，經(jīng)適當(dāng)稀釋後，以比色法或原子吸收光譜儀配合鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液與標(biāo)準(zhǔn)檢線而定?；一磻?yīng)需嚴(yán)防鐵污染，所需容器必須浸泡酸液後充分清洗方可使用。 可透析鐵分析 取定透析液，加入蛋白質(zhì)沉澱劑（沉澱劑：透析液1：2，v/v），充分混合後，於沸水浴中加熱10分鐘，4000 ×g心10分鐘去除蛋白質(zhì)沉澱。取上清液置於試管中，加入鐵呈色劑（上清液：鐵呈色劑 =

21、 1：1,，v/v），反應(yīng)10分鐘後，測定波長535 nm吸光值，比對鐵標(biāo)準(zhǔn)檢線求出濃。鐵標(biāo)準(zhǔn)檢線以鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液（線性範(fàn)圍0.5 - 4 ppm）經(jīng)相同之鐵呈色定步驟，測得吸光值後而製作。上清液經(jīng)適當(dāng)消化分解有機(jī)物質(zhì)後，也可以採用原子吸收光譜儀測定其鐵。6. 計算各組之可透析鐵以下公式計算，並以百分比（%）表示：透析液鐵濃(µg Fe/mL)×透析液體積 (mL) 可透析鐵比 (%) 100% 樣品總鐵(µg Fe/g)×20 g每次實驗各種處至少應(yīng)有二重複，每個實驗至少重複次。各次實驗之間沒有顯著差，則實驗結(jié)果可以合併以計算可透析鐵比之平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差，

22、並以標(biāo)準(zhǔn)偏差對平均值之百分代表該分析之變係 (coefficient of variation, CV)。測試樣品鐵可用以實驗組之可透析鐵比平均值對控制組之可透析鐵比平均值之百分表示。正對照組之鐵可用以該組之可透析鐵比平均值對控制組之可透析鐵比平均值之百分表示。7. 結(jié)果評定促進(jìn)鐵吸收之判斷標(biāo)準(zhǔn)為實驗組之鐵可用大於100% + 2 × CV實驗組，表示有促進(jìn)鐵吸收之性質(zhì)，可用值越高越好，以超過ASC組者為最優(yōu)；鐵可用小於100% - 1 × CV實驗組者表示測試樣品可能有抑制鐵吸收之性質(zhì)。（二）體外消化Caco-2細(xì)胞攝鐵實驗：簡稱細(xì)胞實驗(22-32)1. 儀器設(shè)備二氧化

23、碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（CO2 incubator）與細(xì)胞培養(yǎng)操作之基本設(shè)施、迴轉(zhuǎn)式震盪器、原子吸收光譜儀或同儀器、酵素免疫分析儀（ELISA reader）。2. 主要器材75-cm2 培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿（culture flask or culture dish）、彈性矽膠帶（silicon ring）、collagen處之槽細(xì)胞培養(yǎng)盤（collagen treated 6-wells culture dish）、塑膠心管、透析膜MWCO 12,000-14,000（12-14K, Spectra/Por），使用前以去子水浸泡12 hr。細(xì)胞培養(yǎng)盤內(nèi)槽（Transwell insert ring），使用

24、前槽底外部覆以透析膜（圖二），用彈性矽膠帶固定，以70%酒菌後，浸置於無菌水中備用。實驗用玻璃器皿均應(yīng)以酸液浸泡，經(jīng)去子水沖淨(jìng)，去除鐵之污染後方可使用。3. 藥品與試藥細(xì)胞培養(yǎng)基：Minimum Essential Medium (MEM)，配方中含外加鐵，鐵濃可超過 8 g/L細(xì)胞生長培養(yǎng)液（growth medium）簡稱生長液，供細(xì)胞增生與維持之用，組成分含有：DMEM（Dulbeccos Modified Eagle Medium）、10% (v/v) FBS（fetal bovine serum）、25 mmol/L HEPES、1%antibiotic-antimycotic so

25、lutionMEM營養(yǎng)液：攝鐵反應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)液，使用時新鮮配製，以MEM為溶劑，並加入：10 mmol/L PIPES、1% antibiotic-antimycotic solution、hydrocortisone (4 mg/L)、insulin (5 mg/L)、sodium selenite (5 gSe/L)、triiodothyronine (34 g/L)，epidermal growth factor（20g/L）。細(xì)胞清洗液簡稱清洗液，於實驗開始、中途變換培養(yǎng)條件、實驗結(jié)束時，用清洗細(xì)胞，以去除前段培養(yǎng)液的影響，組成份為：140 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM

26、 PIPES（piperazine-N,N-bis-2-ethanesulfonic acid） pH 7.0。除鐵溶液（iron removal solution）：簡稱除鐵液，用減少細(xì)胞上非專一性結(jié)合之鐵，以清洗液為溶劑，於使用時加入鐵螯合劑等其他成分，組成份除清洗液之外，加入：1 mM bathophenanthroline disulfonic acid（BPDS）、5 mM sodium hydrosulfite。EBSS/MES溶劑：使用時新鮮配製，組成份為：Earles balanced salt solution(EBSS)、10 mM MES (2-4-morpholino-

27、ethanesulfonic acid) buffer pH 6.0。鐵對照溶液：供攝鐵實驗中控制組之用，含有EBSS/MES溶劑與10-100mol/L FeSO4。正對照組溶液 (ASC)：供攝鐵實驗中正對照組之用，含有EBSS/MES溶劑、10-100 mol/L FeSO4、ascorbic acid對Fe莫耳比為20：1。負(fù)對照組溶液 (NTA)：供攝鐵實驗中負(fù)對照組之用，含有EBSS/MES溶劑、10-100 mol/L FeSO4、nitrilotriacetic acid對Fe莫耳比為5：1。體外消化用藥品及試劑與體外消化透析法所用相同其他試劑有市售鐵蛋白酵素免疫分析試劑組（F

28、erritin ELISA kit）、Bio-RadDC protein 試劑等4. 細(xì)胞株源與培養(yǎng)條件：Caco-2細(xì)胞株可購自新竹食品工業(yè)研究所或美國ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD)。細(xì)胞培養(yǎng)於生長液中，接種密為5.6×103 cells/cm2，或1.68×104 cells/mL。二氧化碳培養(yǎng)箱之氣體條件為5%CO2/95% air，維持飽和溼，每三天新生長液。細(xì)胞增生至80-100%滿盤 (confluency) 時可進(jìn)繼代培養(yǎng)（subculture）。繼代培養(yǎng)時，以trypsin-EDT

29、A處使細(xì)胞脫盤底，心收集，計細(xì)胞目，調(diào)整濃至接種密以進(jìn)培養(yǎng)。5. 攝鐵實驗用細(xì)胞準(zhǔn)備：取80-100% 滿盤的Caco-2細(xì)胞，以trypsin-EDTA處收集，用生長液將細(xì)胞密調(diào)為5×104 cells/cm2 或1.65×105 cells/mL，置入槽培養(yǎng)盤，每2天新一次生長液，於12 - 14天後細(xì)胞增生達(dá)到90 100% 滿盤，即可開始攝鐵實驗。此時細(xì)胞間生成緊密的構(gòu)造（tight intercellular junctions），使物質(zhì)無法從細(xì)胞間隙通透，而必須從細(xì)胞膜攝入。6. 試驗樣品之處視健康食品的物性而定，健康食品為液態(tài)，並且需要消化即可吸收，則直接進(jìn)細(xì)

30、胞攝鐵實驗。健康食品為固態(tài)，或必須經(jīng)過消化後方能發(fā)揮作用或吸收，則需進(jìn)下述之消化反應(yīng)：取適食品與120 mmol/L NaCl溶液混合均質(zhì)，使均質(zhì)液之蛋白質(zhì)濃約為0.5 mg/10 mL，並以6N HCl調(diào)整至pH 2後，取10 mL均質(zhì)液加入胃液0.5 mL，置於塑膠心管中，加蓋後水平放置，於37下震盪反應(yīng)1小時而得胃消化物，然後以1 mol/L NaHCO3逐滴加入以調(diào)整其酸鹼達(dá)pH 6.0，加入2.5 mL胰液，以NaOH調(diào)整至pH 7.5，最終體積以120 mmol/L NaCl溶液定容為15 mL，暫稱為待消化物，即用於細(xì)胞攝鐵實驗，實驗程如圖二所示。7. 實驗設(shè)計及步驟每次攝鐵試驗

31、應(yīng)包含以下組別：（1）控制組：以鐵控制溶液替代實驗樣品，可依需要採用單一鐵或系鐵。（2）正對照組：以ASC溶液替代實驗樣品，可依需要採用單一鐵或系鐵。（4） 負(fù)對照組：以NTA溶液替代實驗樣品，可依需要採用單一鐵或系鐵。（5） 實驗組：健康食品溶液或待消化物，含鐵與控制組相同，可依需要採用單一鐵或系鐵。健康食品添加含鐵成分，應(yīng)符合我國食品衛(wèi)生管法、食品添加物使用範(fàn)圍與用標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)法規(guī)。每次實驗各種處至少應(yīng)有二重複，每個實驗至少重複次。各次實驗之間沒有顯著差，則實驗結(jié)果可以合併進(jìn)統(tǒng)計分析，計算平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差。攝鐵實驗開始時，先將生長液吸除，以MEM清洗次，各槽加入MEM營養(yǎng)液1.0 mL。每槽

32、置入一個透析內(nèi)槽，內(nèi)槽中加入2.5 mL各組樣品液或待消化物，加蓋後置於迴轉(zhuǎn)釋震盪器反應(yīng)，震盪速每分鐘6轉(zhuǎn)，反應(yīng)時間2小時，然後移去內(nèi)槽，培養(yǎng)盤移入培養(yǎng)箱繼續(xù)反應(yīng)滿24小時，即可收集細(xì)胞以供分析。每次實驗必有含細(xì)胞，但其他處均相同之空白組以供鐵定對照之用。攝鐵反應(yīng)結(jié)束時，先收集空白組槽內(nèi)全部溶液，以供鐵之定。其餘含細(xì)胞各槽，以2 mL清洗液清洗細(xì)胞後吸除，加入2 mL去子水，於4房中以桌上型超音波震盪器震盪處15分鐘，刮下細(xì)胞，並收集槽內(nèi)全部溶液，貯存於 -20，以待後續(xù)分析。8. 分析項目與方法各槽之細(xì)胞蛋白質(zhì)可以0.5 N NaOH完全溶解細(xì)胞後，採用Bio-Rad DC protein

33、試劑半微法分析定。細(xì)胞鐵蛋白含以市售酵素免疫分析試劑組依其明定分析，結(jié)果以每槽鐵蛋白總表示。食材、培養(yǎng)液、細(xì)胞液等之鐵含以原子吸收光譜儀定。9. 統(tǒng)計分析與計算每次實驗各種處至少應(yīng)有二重複，每個實驗至少重複次。各次實驗之間沒有顯著差，則實驗結(jié)果可以合併用於計算鐵蛋白之平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差，並以標(biāo)準(zhǔn)偏差對平均值之百分代表該分析之變係 (coefficient of variation, CV)。採用單一鐵時，測試樣品之鐵可用以實驗組鐵蛋白平均值對鐵控制組鐵蛋白平均值之百分表示。正對照組之鐵可用以該組鐵蛋白平均值對鐵控制組鐵蛋白平均值之百分表示。負(fù)對照組之鐵可用以該組鐵蛋白平均值對鐵控制組鐵蛋白平均值

34、之百分表示。採用系鐵時，各樣品先以鐵蛋白對樣品鐵製作劑反應(yīng)曲線並計算斜。測試樣品之鐵可用以實驗組斜對鐵控制組斜之百分表示。正對照組之鐵可用以該組斜對鐵控制組斜之百分表示。負(fù)對照組之鐵可用以該組斜對鐵控制組斜之百分表示。10. 結(jié)果評定促進(jìn)鐵吸收功能之判斷標(biāo)準(zhǔn)為實驗組鐵可用大於100% + 2 × CV實驗組，表示有測試樣品有促進(jìn)鐵吸收之性質(zhì)，可用越高越好，以超過ASC組者為最優(yōu)；鐵可用小於100% - 1 × CV實驗組者表示測試樣品可能有抑制鐵吸收之性質(zhì)。圖二、 體外消化Caco-2細(xì)胞攝鐵實驗評估鐵可用之實驗程圖(29)（三）動物實驗：大鼠血紅素再生法，簡稱血紅素再生法

35、(33-43) ，主要考資為政院衛(wèi)生署委託計畫研究報告改並建我國保健食品補(bǔ)鐵機(jī)能評估的檢測方法(36)1. 實驗動物實驗動物採用Wistar雄性大鼠，鼠齡限定為乳，約四週大，體重宜超過70公克，以快速達(dá)到缺鐵貧血階段，縮短耗鐵期時間。動物體重較大，則耗鐵期時間必然增長，方能達(dá)到必要的缺鐵貧血程。實驗動物之養(yǎng)遵循基本程序，大鼠個別養(yǎng)於鏽鋼絲中，動物室溫維持在25±2，溼維持50%，光暗週期各為12小時。實驗期間供給去子水。水與均採自由攝食。動物管應(yīng)遵循國科會實驗動物管及使用守則(43)。2. 藥品與試劑Drabkins試劑含1 g NaHCO3、50 mg KCN、200 mg K3F

36、e(CN)6 ，溶於1L 蒸餾水中，貯於棕色瓶中備用。本試劑含氰化物，毒性大而危險，可以口吸取，廢液需集中處，可倒入水槽。各種酸鹼試劑與藥品必需無微礦物質(zhì)污染。各項分析用玻璃器皿均應(yīng)以酸液浸泡，經(jīng)去子水沖淨(jìng)，去除鐵之污染後方可使用。3. 配方基礎(chǔ)採用AIN-76或AIN-93G配方，但其碳水化合物完全採用玉米澱粉，其礦物質(zhì)混合物中加鐵，其組成於表二，此之鐵濃應(yīng)超過3 ppm。標(biāo)準(zhǔn)對照組於血紅素再生期簡稱再生期用含鐵稱為鐵標(biāo)準(zhǔn)，乃以基礎(chǔ)添加FeSO4·7H2O而配成之一套四種鐵濃之，鐵的含分別有6、12、18及24 ppm。實驗組再生期用含鐵稱為試驗，乃以測試樣品提供鐵質(zhì)，加上基礎(chǔ)調(diào)配

37、而成之一套四種鐵濃之，使鐵的含分別為6、12、18及35 ppm，同時測試樣品所提供之熱營養(yǎng)素應(yīng)從基礎(chǔ)中扣除，使試驗之熱營養(yǎng)素比與鐵標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)。每一種樣品需要一套含四種鐵濃之試驗。健康食品添加含鐵成分，應(yīng)符合我國食品衛(wèi)生管法、食品添加物使用範(fàn)圍與用標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)法規(guī)。4. 實驗設(shè)計實驗組別應(yīng)包括：（1） 基礎(chǔ)組：6-7隻Wistar鼠，實驗期間全程以基礎(chǔ)。（2） 標(biāo)準(zhǔn)對照組：共有4組，每組採用6-7隻Wistar鼠，再生期間以鐵標(biāo)準(zhǔn)，每組一種鐵濃。（3） 實驗組：每一種樣品需要4組動物，每組採用6-7隻Wistar鼠，再生期間以試驗，每組一種鐵濃。表二、大鼠血紅素再生法用基礎(chǔ)AIN-76與AIN-9

38、3G配方的組成AIN-761 (g/kg) AIN-93G2 (g/kg)Casein 200.000 Casein 200.000 Cornstarch 650.000 Cornstarch 629.486 Soybean oilFiberMineral mix AIN76,Fe-free3,DL-methionineCholine bitartrate3.000 2.000 50.000 50.000 35.000 Soybean oil Fiber Fe-free5 L-cystine Choline bitartrate BHT 3.000 2.500 0.014Total 1000.

39、000 Total 1000.000 1 AIN 1977 (38)2 Reeve et al. 1993 (41)3 AIN-76 Fe-free mineral premix contains the following components in g per kgmixture: calcium phosphate, dibasic, 500; tri-potassium citrate, monohydrate, 220;NaCl, 74; K2SO4, 52; MgO, 24; zinc carbonate, 1.6; manganous carbonate, 3.5;cupric

40、carbonate, 0.3; KIO3, 0.01; sodium selenite, 0.01; chromium potassium sulfate,12 hydrate, 0.55; finely powdered sucrose, 124.4 Vitamin mix AIN 76 contains the following components in per kg feed: thiamin.HCl,0.6 g; riboflavin, 0.6 g; pyridoxine.HCl, 0.7 g; nicotinic acid, 3.0 g; D-calciumpantothenat

41、e, 1.6 g; folic acid, 0.2 g; D-biotin, 0.02 g; cyanocobalamin, 0.001 g;retinyl palmitate, 400,000 IU; dl-(all-rac)-tocopheryl acetate, 5000 IU;cholecalciferol, 100,000 IU; menadione, 0.005; finely powdered sucrose, 980.5 Iron-free mineral mix AIN-93G contains the following components in g per kgmixt

42、ure: calcium carboneta, 357; potassium phosphate, monobasic, 157;tri-potassiumcitrate, monohydrate, 102; NaCl, 74; K2SO4, 46; MgO, 24; zinc carbonate, 1.65;manganous carbonate, 0.63; cupric carbonate, 0.3; KIO3, 0.01; sodium selenite,0.01025; chromium potassium sulfate, 12 hydrate, 0.275; ammonium p

43、aramolybdate,15 70.000 50.000 Mineral mixAIN93G, 35.000 10.000 Vitamin mix AIN93G6 10.000 Vitamin mixture AIN7644 hydrate, 0.00795; sodium meta-silicate, 9 hydrate, 1.45; lithium chloride, 0.0174; boric acid, 0.0815; sodium fluoride, 0.0635; nickel carbonate, 0.0318; ammonium vanadate, 0.0066; finel

44、y powdered sucrose, 235.6 Vitamin mix AIN 93G contains the following components in g per kg feed:thiamin.HCl, 0.6; riboflavin, 0.6; pyridoxine.HCl, 0.7; nicotinic acid, 3.0; D-calcium pantothenate, 1.6; folic acid, 0.2; D-biotin, 0.02; cyanocobalamin, 0.0025; retinyl palmitate, 400,000 IU; dl-(all-r

45、ac)-tocopheryl acetate, 7500 IU; cholecalciferol, 100,000 IU; K-1, 0.075; finely powdered sucrose, 974.655.5. 實驗方法及步驟根據(jù)AOAC的標(biāo)準(zhǔn)實驗程序，大鼠採耗鐵期及再生期階段養(yǎng)。動物實驗之程如圖三所示。 耗鐵期 全乳大鼠餵基礎(chǔ)，期間每週紀(jì)動物體重，養(yǎng)期間可以尾巴採血法採取血樣，測血紅素濃以追蹤血紅素值變化，直到血紅素至6 g/dL以下，大約需14至21天。 再生期 大鼠達(dá)到預(yù)定之缺鐵貧血程後，依其體重分組使各組平均體重相當(dāng)，組間沒有顯著差。取一組餵基礎(chǔ)。取四組餵鐵標(biāo)準(zhǔn)，每組一種鐵濃。

46、每一種試驗需取四組大鼠，每組餵一種鐵濃。再生期間定時紀(jì)攝取，於第10與14天秤體重，並自尾巴採血測血紅素值。6. 分析項目與方法 鐵分析 或測試樣品經(jīng)灰化後，灰份以濃HCl溶解完全，經(jīng)適當(dāng)稀釋後，以原子吸收光譜儀配合鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液與標(biāo)準(zhǔn)檢線而定。灰化反應(yīng)需嚴(yán)防鐵污染，所需容器必須泡酸後充分清洗方可使用。血紅素分析 採用cyano-methemoglobin法，以Drabkins試劑呈色，反應(yīng)在玻璃或塑膠試管中進(jìn)，每個樣品需要二重複分析。每支試管中加入5.0 mL Drabkin's 試劑與全血20 l，對照組以蒸餾水替代全血。試劑與樣品充份振盪混合後，靜置10 min，以分光光譜儀測波長5

47、40 nm之吸光值，經(jīng)乘以36.8可得血紅素濃以g/dL表示。7. 計算與統(tǒng)計分析再生期間鐵攝取以各組鐵濃乘以攝取重而得。大鼠的血液體積以每公克體重有0.067 mL 估計，血紅素的含鐵以0.335% 計算。代表鐵用之生物指標(biāo)可採用再生後血紅素濃、再生期血紅素濃增加或再生期血紅素鐵增加，其計算原則於表三。表三 血紅素再生法可用的鐵用指標(biāo)鐵可用相關(guān)項目 計算原則血紅素增加 再生期之血紅素濃耗鐵期結(jié)束之血紅素濃 （mmol/L）血紅素總鐵 大鼠體重 ×0.067 ×血紅素濃 ×0.335%（mol Hb/ rat）血紅素鐵增加 再生期之血紅素總鐵耗鐵期結(jié)束之血紅素總鐵

48、（mol Fe/ rat）各組之間各項指標(biāo)的差以單因子變方檢定（generalized linear model）後，再以Duncans multiple range test分析。將各項鐵用指標(biāo)對應(yīng)添加鐵或再生期鐵攝取以Pearsons correlation test進(jìn)線性迴歸分析，線性關(guān)係顯著時（p < 0.05），計算試驗組對標(biāo)準(zhǔn)組之迴歸係之比，作為試驗樣品之相對生物價 (RBV，relative biological value)。8. 結(jié)果評定試驗各組之鐵用指標(biāo)均顯著高於鐵濃相當(dāng)之鐵標(biāo)準(zhǔn)組，而且試驗樣品之相對生物價大於100時，表示其鐵可用優(yōu)於FeSO4，可適用為促進(jìn)鐵吸收之

49、健康食品。試驗各組之鐵用指標(biāo)與鐵濃相當(dāng)之鐵標(biāo)準(zhǔn)組無顯著差或顯著較低，而且其相對生物價低於100時，表示其鐵可用如FeSO4，並適用為促進(jìn)鐵吸收之健康食品。（四）人體實驗：血紅素增生法(43)1. 實驗計劃需遵循我國法規(guī)，經(jīng)研究單位或主管機(jī)關(guān)之人體實驗審查委員會審核同意後始得進(jìn)，並遵循床實驗之各項規(guī)定。受試者須聽取研究明而充分解實驗條件與目的後，簽訂同意書始得與實驗。健康食品添加含鐵成分，應(yīng)符合我國食品衛(wèi)生管法、食品添加物使用範(fàn)圍與用標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)法規(guī)。2. 受試對象：徵求有輕微缺鐵貧血 (血紅素濃 10-11 g/dL，鐵蛋白濃 < 12g/L)癥，無懷孕、無任何鐵吸收常之疾病史之婦，隨機(jī)分

50、為實驗組與對照組，各組約20名。先進(jìn)一般常規(guī)體檢，測身高與體重，並抽血以測紅血球目（red blood cell count, RBC count）、血比容（hematocrit,Hct）、平均紅血球容積（mean corpuscular volume, MCV）、平均紅血球血紅素（mean corpuscular hemoglobin, MCH）、平均紅血球血紅素濃（mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC）、血紅素濃（hemoglobin, Hb）、血清鐵（serum iron）、血清運鐵容（total ironbinding capa

51、city）運鐵蛋白飽和transferrin saturation與血清鐵蛋白濃（serum ferritin），以供評定其鐵營養(yǎng)況。3. 實驗設(shè)計：依產(chǎn)品特性採用雙盲或單盲法進(jìn)，並應(yīng)製備合之安慰劑以供用。實驗組依照產(chǎn)品明服用測試食品，對照組則依照產(chǎn)品明服用安慰劑。研究人員應(yīng)指導(dǎo)受試者定期取測試食品或安慰劑，並且以服用紀(jì)或其他合可之指標(biāo)追蹤服用況，確認(rèn)受試者之合作。服用時間為續(xù)三個月，可視產(chǎn)品特性而延長時間，但宜超過半。4. 受試期飲食管：受試期間，研究人員應(yīng)明定受試者之飲食原則，嚴(yán)禁服用與實驗無關(guān)之含鐵補(bǔ)充劑，以盡維持日常之飲食習(xí)慣為宜，並且督導(dǎo)受試者遵。其飲食況應(yīng)在營養(yǎng)師指導(dǎo)下，每個月紀(jì)三

52、天飲食，以供評估實驗期間之飲食變化。5. 健康紀(jì)：受試者每個月測身高與體重，並記各項健康變化，如疾病、服藥、月經(jīng)況等等。6. 血液檢驗：服用測試食品滿6週與12週時，抽血檢驗紅血球目、血比容、MCV、MCH、MCHC、血紅素濃、血清鐵、血清運鐵容與鐵蛋白濃，以供評定其鐵營養(yǎng)況。各項檢驗採用床檢驗自動分析方法執(zhí)。 7. 統(tǒng)計分析：組內(nèi)各項指標(biāo)隨服用時間的變化以paired t-test檢測其差性；各指標(biāo)的變化以服用後對服用前之差值表示，實驗組與對照組之間各指標(biāo)變化的差性以student t test 檢測。統(tǒng)計顯著性以p < 0.05為檢測標(biāo)準(zhǔn)。8. 結(jié)果評定：測試食品服用前後，平均紅血球

53、容積、血紅素濃與血比容在統(tǒng)計上有顯著的增加，而且此三指標(biāo)之變化在實驗組顯著高於對照組，即代表該產(chǎn)品具有促進(jìn)鐵吸收之功能。四、考文獻(xiàn)：1. 張美、彭珍芳、蕭馨 (1998a) 實驗用齧齒動物配方AIN-93G之鐵質(zhì)生體可用。中華營誌 23:239-250。2. Bruner AB, Joffe A, Duggan AK, Casella JF and Brandt J (1996) Randomized study ofcognitive effects of iron supplementation in non-anemic iron-deficient adolescent girls.

54、Lancet 348:992-9963. Food and Agriculture Organization (1988) Requirements of vitamin A, iron, folateand vitamin B12. Rome.4. Forbes AL, Adams CE, Arnaud MJ, Chichester CO, Cook JD, Harrison BN, Hurrell RF,Kahn SG, Morris ER, Tanner JT and Whittaker P (1989) Comparison of in vitro, animal, and clini

55、cal determinations of iron bioavailability: international nutritional anemia consultative group task force report on iron bioavailibility. Am. J. Clin. Nutr. 49:225-238. 5. Gleerup A, Rossander-Hulthen L, Gramatkovski E and Hallberg L (1995) Ironabsorption from the whole diet: comparison of the effect of two different distribution of daily calcium intake. Am. J. Clin. Nutr. 61:97-104.6. Hallberg L (1981) Bioavailability of dietary iron in man. Ann. Rev. Nutr. 1:123-148.7. Hallberg L