玉竹提取物A對1型糖尿病小鼠血糖及細胞因子的調(diào)控作用(1)

1、    玉竹提取物A對1型糖尿病小鼠血糖及細胞因子的調(diào)控作用(1)    目的：研究1型糖尿病（DM）的發(fā)生與細胞因子作用的關(guān)系及玉竹提取物A（EAPAOA）對鏈脲佐菌素（STZ）誘導的1型糖尿病小鼠（下稱STZ小鼠）血糖和細胞因子的影響。 方法：昆明小鼠60只，對EAPAOA進行急性毒性實驗。采用STZ小劑量多次注射誘導1型糖尿病小鼠模型，正常對照組與DM對照組各1組，實驗組分三個劑量腹腔注射等體積EAPAOA ，用藥4周監(jiān)測血糖變化，4周后應(yīng)用ELISA法檢測外周血血清IL4、IL10、IFN含量。結(jié)果： 急性

2、毒性實驗顯示EAPAOA毒性作用很低，LD50=14.5124g/Kg；DM對照組與正常對照組比較IL4、IL10降低，IFN升高；實驗組與DM對照組比較血糖明顯降低，IL4、IL10升高，IFN降低。結(jié)論：1型DM的發(fā)生與細胞因子IL4、IL10降低，IFN升高有關(guān)，EAPAOA安全范圍大，可調(diào)節(jié)STZ小鼠發(fā)病過程中細胞因子水平，干預(yù)1型DM發(fā)生發(fā)展。關(guān)鍵詞： 1型糖尿病；玉竹提取物 A；急性毒性實驗；細胞因子         1型糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是胰島細胞進行性損害和胰島素分泌

3、不足的自身免疫性疾病，其詳細的發(fā)病機理尚未完全闡明。一般認為其發(fā)病除了與遺傳因素、環(huán)境因素有關(guān)外，免疫應(yīng)答是啟動因素，表現(xiàn)為細胞免疫和體液免疫均有異常，而細胞因子在此過程中可能起著主導作用1,2。玉竹（Polygonatum Odoratum （Mill.）Druce）為百合科黃精屬中草藥，含有多糖、生物堿、甾體皂甙等。玉竹的干燥根莖，性平、味甘，具養(yǎng)陰、潤燥、除煩、生津止渴等功效,有強心、擴張血管、降血糖、降血脂、和抗腫瘤等作用35。本實驗所采用的玉竹提取物A（extraction A of polygonatum odoratum, EAPAOA）是玉竹的干燥根莖經(jīng)水醇法（30%乙醇）提取

4、而得，通過觀察它對STZ小鼠血糖血清IL4、IL10、IFN水平的影響，旨在探討EAPAOA對STZ小鼠血糖和細胞因子的調(diào)控作用。1 材料和方法11 材料111 實驗動物        昆明小鼠60只，雌雄各半，體重1820g ；C57BL小鼠50只，雄性，體重1820g,購自中國醫(yī)科大學實驗動物中心。112 主試劑     EAPAOA：玉竹產(chǎn)自錦州凌海市溫滴樓鄉(xiāng)，將2.5Kg玉竹干燥根莖洗凈、去須根、切碎，30%乙醇浸提，G4過濾分離，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)回收乙醇，得黃棕色沉淀

5、烘箱干燥后成780g浸膏備用，使用前分別配制成所需濃度的溶液，高壓滅菌。STZ（美國sigma公司）；小鼠IL4、IFN試劑盒（進口分裝，北京晶美公司）；小鼠IL10試劑盒（原裝進口，美國Bender MedSystems公司）；血糖試紙（美國強生公司）；尿糖試紙（廣州越秀東方新科技研究所研制生產(chǎn)）。113 主儀器        血糖儀（OneTouchI型血糖儀，美國強生公司）；酶標儀（DG3022A型，上海）。12 實驗方法121 急性毒性試驗     

6、0;  60只重約1820g的健康昆明小鼠(雌雄各半)隨機分成6組，每組10只，每只腹腔注射相應(yīng)劑量的EAPAOA 0.5ml。一次性給藥后即刻觀察中毒癥狀并記錄死亡動物只數(shù)。122 實驗動物分組及動物模型制備     將50只C57BL小鼠隨機分為5組，其中實驗組分為3個劑量組，以近似LD50 1/15劑量的1g/Kg作為基礎(chǔ)給藥量，另取其2倍、4倍量，即：1g/Kg(EAPAOA1組)、2g/Kg（EAPAOA2組）、4g/Kg（EAPAOA3組）；設(shè)正常對照組（control）和糖尿病對照組(DM)，每組10只。應(yīng)用0.1mol

7、/l枸櫞酸鈉緩沖液（pH4.4）配制成0.4STZ溶液，按40mg/Kg劑量腹腔注射，每天1次，連續(xù)5天，每周分別測血糖、尿糖1次，動態(tài)監(jiān)測1型DM模型的形成，除正常對照組小鼠外（只注射等體積枸櫞酸鈉緩沖液），其余組制備1型DM模型，以血糖11.4mmol/l，尿糖 以上2周，為模型制做成功6。低于此值棄去。小鼠自由飲食、飲水，不限量、標準飼料（錦州醫(yī)學院實驗動物中心提供）。正常對照組與DM對照組，腹腔注射生理鹽水0.5ml，每日1次，共4周；EAPAOA1組EAPAOA 1g/Kg、EAPAOA2組EAPAOA 2g/Kg、EAPAOA3組EAPAOA 4g/Kg，分別以等體積0.5ml腹腔

8、注射，每日1次，共4周。123 血糖、尿糖測定        空腹血糖測試采用末梢全血快速血糖測定法，剪尾取血，血糖儀檢測。尿糖水平采用廣州越秀東方新科技研究所研制生產(chǎn)的尿糖試紙檢測。用藥前及用藥過程中每周檢測一次，共4周。124 細胞因子檢測        小鼠死前用摘眼球法取血，4離心分離血清，分裝成100l置-20保存。采用ELISA試劑盒，操作方法按試劑盒說明進行。全部標本同批測定。125 統(tǒng)計學處理  &#

9、160;     采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為差異非常顯著。2 實驗結(jié)果21 小鼠急性毒性試驗結(jié)果根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果決定劑量范圍11.1734，12.4897，13.9609，15.6055，17.4439，19.5gKg-1，劑距為1.1178。雌雄小鼠在注射EAPAOA后，均出現(xiàn)四肢伏地、蜷縮，高劑量出現(xiàn)跳躍、死亡。19.5gKg-1組小鼠約10min死亡；17.4439gKg-1組小鼠約25min死亡，存活2只；15.60

10、55gKg-1組小鼠約60min后有6只死亡；13.9609gKg-1組小鼠死亡5只； 12.4897gKg-1組小鼠死亡2只；11.1734gKg-1組小鼠死亡1只。存活小鼠約2后有恢復(fù)，但活動減少，4后開始進食。7后解剖觀察到內(nèi)臟器官無異常。用寇氏法計算LD50為14.5124gKg-1，95%可信限為13.564215.4606gKg-1。    22 模型制備STZ溶液腹腔注射,每天一次,連續(xù)注射5天后,小鼠血糖呈持續(xù)上升趨勢,在注射后15天至20天,血糖達到高峰狀態(tài),以后稍有一定幅度的下降,但一直穩(wěn)定在較高水平。第2周開始,1/3模型鼠尿糖出現(xiàn)

11、 、    不等，到第4周,90%小鼠尿糖出現(xiàn)    。各組1型DM小鼠隨著血糖,尿糖水平上升,出現(xiàn)飲食、飲水量增多改變。            作者：金艷書 莊曉燕吳學敏 李宏偉劉運芝【關(guān)鍵詞】玉竹摘目的：研究1型糖尿?。―M）的發(fā)生與細胞因子作用的         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收

12、集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。23 血糖測定用藥前DM對照組小鼠空腹血糖水平與實驗組無顯著性差異；用藥后DM對照組小鼠空腹血糖水平明顯高于EAPAOA各組；用藥后1周 EAPAOA1組與DM對照組比較P<0.05，24周 P<0.01；EAPAOA2組、3組與DM對照組比較均P<0.01；EAPAOA1組與EAPAOA2組、3組比較P<0.01；EAPAOA2組與EAPAOA3組比較，無明顯差異（P>0.05）。見表1。24 血清IL4、IL10、IFN水平E

13、LISA法測定各組小鼠血清IL4、IL10、IFN水平結(jié)果顯示，與正常對照組比較，DM對照組IFN水平明顯升高，IL4、IL10水平明顯降低；與DM對照組比較EAPAOA各組IFN水平有不同程度的降低，IL4、IL10水平有不同程度升高，接近甚至超過正常水平，EAPAOA1組差異顯著（P<0.05）；EAPAOA2組、3組差異非常顯著（P<0.01）；實驗組組間比較，EAPAOA1組與2組、3組比較P<0.01；2組與3組比較P<0.05。見表2。表1 EAPAOA對STZ小鼠血糖的影響 (略)注：與DM對照組比較，* P<0.05， *P<0.01；EAP

14、AOA2、3組與 EAPAOA1比較，P<0.01。表2 EAPAOA對STZ小鼠血清IL4、IL10、IFN水平影響(略) 注：與DM對照組比較，* P<0.05, *P<0.01；EAPAOA2、3組與 EAPAOA1比較，P<0.01；EAPAOA2與3組比較，#P<0.05。3 討論許多證據(jù)支持型糖尿病是一種因免疫調(diào)節(jié)機制紊亂所導致的自身免疫性疾病，研究發(fā)現(xiàn)1型DM的發(fā)生、進展由Th1Th2型自身反應(yīng)性T細胞之間平衡情況所決定。Th1細胞促進1型DM的發(fā)生、發(fā)展，而Th2細胞則起保護作用7。Th1分泌IFN，對 Th0向Th2分化有抑制作用，而Th2分泌的

15、IL4、IL10，增強Th2抑制Th1的生成，Th1是Th2的抑制細胞，反之亦然。它們在免疫調(diào)節(jié)中互相拮抗，起著十分微妙的作用。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）是一種含亞硝基化合物，能特異性破壞胰島細胞，機制之一是通過誘導NO的合成增加對胰島細胞的氧化侵襲，與1型DM 病人發(fā)病時體內(nèi)氧化侵襲增加相類似。小劑量多次注射STZ誘導糖尿病模型可有效的模擬1型DM病程及發(fā)病機理，適用于1型DM發(fā)病機理的研究8,9。本研究成功建立STZ小劑量多次注射誘導1型糖尿病動物模型，結(jié)果表明DM對照組與正常對照組比較IFN水平明顯升高，IL4、IL10水平明顯降低，這與以往的大量報道相符合10,

16、11，進一步證實了1型DM的發(fā)生與細胞因子密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，EAPAOA腹腔注射可降低STZ小鼠血糖。上調(diào)外周血IL4、IL10的表達，下調(diào)IFN的表達。因而提示EAPAOA對STZ小鼠的降糖作用與調(diào)節(jié)細胞因子比例失衡，糾正免疫失控狀態(tài)，調(diào)節(jié)Th0、 Th1細胞向Th2轉(zhuǎn)化有關(guān)。從而使Th1細胞介導的胰島炎和細胞損傷過程減輕或中斷。通過免疫干預(yù)降低血糖，起到治療作用。實驗發(fā)現(xiàn)，不同劑量EAPAOA 治療效果不同。本實驗通過EAPAOA三個劑量組對STZ小鼠免疫干預(yù)作用的對比觀察，不論是血糖，還是血清細胞因子含量EAPAOA2組、3組，即2g/Kg、4g/Kg，效果均優(yōu)于1g/Kg組（P<

17、;0.01）。2g/Kg組與4g/Kg組比較血糖值無顯著性差異，血清細胞因子含量上卻有顯著性差異，4g/Kg組優(yōu)于2g/Kg組（P<0.05）。因而提示，隨著藥物劑量的增加，藥效也隨之顯著，免疫系統(tǒng)對此比較敏感，首先體現(xiàn)出來。如增大用藥劑量或長期用藥是否能在分子免疫學水平得到改善的基礎(chǔ)上，使細胞與組織損傷程度上得到徹底改善，有待進一步研究。目前DM已成為一種發(fā)病率高且呈逐年上升趨勢的常見病。1型糖尿病占糖尿病患者總數(shù)510，全國1型DM總數(shù)至少100萬，其中多數(shù)為兒童及青少年患者。他們需依靠外源胰島素存活，造成無數(shù)家庭精神上和經(jīng)濟上的巨大壓力。EAPAOA急性毒性實驗結(jié)果顯示，LD50=

18、14.5124 gKg-1是本實驗有效劑量的14.5倍，顯效劑量的3.6倍，安全性大，加之天然性、來源廣泛、制備方便，有望成為1型DM免疫干預(yù)的新型防治措施。對其藥物成分、用藥劑量、降糖機制還有待進一步研究。參考文獻1 Liblau RS,Singer SM,Medevitt HO.Th1 and Th2 cells in the pathogenesis of organspecific autoimmue disease.Immunol Today, 1995,16:34382 Rabinoyitsh A,Suare WL.Cytokines in the pathogenesis of

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