檢測(cè)丙型肝炎患者NS5區(qū)抗體的臨床意義探討

1、檢測(cè)丙型肝炎患者NS5區(qū)抗體的臨床意義探討【摘要】目的檢測(cè)慢性丙型肝炎患者和14例HCV原發(fā)感染后NS5抗體長(zhǎng)達(dá)一年半的動(dòng)態(tài)變化，探討NS5抗體的臨床意義。 方法應(yīng)用重組NS5抗原，建立EIA方法進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果慢性丙型肝炎患者抗-NS5抗體陽(yáng)性率為60.48%，HCV感染后一月抗-NS5抗體陽(yáng)性率為16.35%，三月為75%。 結(jié)論抗-NS5抗體無(wú)早期診斷價(jià)值?？?NS5抗體持續(xù)陽(yáng)性者，血清ALT多明顯升高，抗-NS5抗體與肝臟疾病活動(dòng)性相關(guān)。丙型肝炎患者中存在抗-C、抗-NS3、抗-NS4抗體陰性，而抗-NS5抗體單獨(dú)陽(yáng)性，表明檢測(cè)抗-NS5抗體具有獨(dú)特的診斷價(jià)值。【主題詞】肝炎，丙型肝炎

2、抗體免疫酶技術(shù) Detection of antibody to HCV NS5 and its clinical significanceLi Qingsheng*, Guo Jianping, Tao Qimin,et al.*Institute of Hepatology,Beijing Medical University, Beijing 100044【Abstract】ObjectiveTo detect the antibodies to HCV NS5 as well as HCV C,NS3 and NS4 in 115 cases of patients with chro

3、nic hepatitis C and 115 serial blood samples of 14 cases of post-transfusion hepatitis C. MethodsThe recombinant HCV NS5 antigen was used to establish EIA to capture the anti-HCV NS5 antibody. ResultsWe discovered that there were a few chronic hepatitis C patients (HCV RNA positive) and acute hepati

4、tis C patients who were anti-C, NS3 and NS4 Ab negative,while only anti-NS5 Ab was positive.The dynamic changes of anti-NS5 Ab were correlated with the serum ALT in most patients,indicating that anti-NS5 Ab may reflect liver damage and disease activity to some extent. ConclusionsThe results show tha

5、t detection of antibody to HCV NS5 has a unique value in HCV diagnosis.【Subject words】 Hepatitis CHepatitis antibodiesImmunoassy,enzyme丙型肝炎病毒(HCV)感染人體后果嚴(yán)重，急性丙型肝炎約40%60%轉(zhuǎn)為慢性，慢性丙型肝炎20%30%將進(jìn)展為肝硬化，此外，HCV感染還和肝癌發(fā)生有關(guān)1。所以，研制敏感特異的HCV診斷試劑具有重要意義。雖然目前診斷HCV感染的第二代抗-HCV試劑有較高的敏感性與特異性，但仍有為數(shù)不少的假陰性和假陽(yáng)性2,3。最近國(guó)外推出了第三代抗-

6、HCV診斷試劑,它是在第二代的基礎(chǔ)上增加NS5抗原而成，其敏感性與特異性較第二代試劑又有所提高4。為了研制我國(guó)第三代抗-HCV診斷試劑,探討檢測(cè)NS5區(qū)抗體的意義，我們?cè)诖竽c桿菌中高效表達(dá)了NS5蛋白7。用此重組抗原檢測(cè)丙型肝炎患者的NS5區(qū)抗體，發(fā)現(xiàn)NS5抗原具有優(yōu)勢(shì)抗原表位，在HCV感染者NS5區(qū)抗體單獨(dú)陽(yáng)性?，F(xiàn)報(bào)道如下:材料與方法1.血清標(biāo)本：115例慢性丙型肝炎患者血清為北京醫(yī)科大學(xué)肝病研究所血清庫(kù)保存的血清，病程超過(guò)半年，ALT升高，HCV RNA陽(yáng)性(RT-PCR，5非編碼區(qū))。正常人血清95份為北京醫(yī)科大學(xué)肝病研究所保存，無(wú)輸血史及肝病史，ALT正常，抗-HCV陰性(第二代EIA

7、)。14例急性丙型肝炎患者共129份系列血清，包括受血前14份，HCV感染后115份(受血后255天、555天、90天、120天、150天、270天、360天和540天采集的標(biāo)本)，由中國(guó)藥品生物制品檢定所汪興太提供。2.包被抗原：檢測(cè)慢性丙型肝炎患者所用核心區(qū)C和NS3區(qū)重組抗原由郭建平副研究員提供。NS4區(qū)重組抗原由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院馬賢凱教授惠贈(zèng)，NS5區(qū)重組抗原由北京醫(yī)科大學(xué)肝病研究所表達(dá)。檢測(cè)急性丙型肝炎系列血清所用抗原，C區(qū)為C11，NS3區(qū)為C7(日本東燃公司)，NS4區(qū)抗原(加拿大Yes公司)，NS5區(qū)重組抗原由北京醫(yī)科大學(xué)肝病研究所表達(dá)。3.主要試劑及材料：Hae為華美生物工程公

8、司產(chǎn)品，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG為Boehringer Mannheim產(chǎn)品，酶標(biāo)板為丹麥Nunc公司產(chǎn)品，HCV RT-PCR試劑盒由北京醫(yī)科大學(xué)肝病研究所生產(chǎn)。4.酶免疫試驗(yàn)(EIA)：按常規(guī)方法進(jìn)行。具體方法參照北京醫(yī)科大學(xué)肝病研究所生產(chǎn)的抗-HCV試劑盒說(shuō)明書(shū)。正常人血清經(jīng)Western blot證實(shí)抗-NS5抗體陰性，然后用酶免疫試驗(yàn)檢測(cè)這些血清抗-NS5抗體的A值5。正常人血清抗-HCV不同區(qū)抗體A均值+2s，作為慢性丙型肝炎患者抗 -HCV不同區(qū)抗體陽(yáng)性的臨界值(cut off)。急性丙型肝炎患者系列血清抗體檢測(cè)方法和檢測(cè)結(jié)果判斷參考文獻(xiàn)6。5.RT-PCR檢測(cè)HCV RN

9、A及HCV酶切分型：應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)HCV RNA，然后用Hae酶切HCV PCR產(chǎn)物(5非編碼區(qū))對(duì)HCV進(jìn)行分型，見(jiàn)文獻(xiàn)7。結(jié)果與討論應(yīng)用HCV C、NS3、NS4和NS5重組抗原，建立EIA，檢測(cè)HCV RNA陽(yáng)性(5端非編碼區(qū)，RT-PCR)的115例慢性丙型肝炎患者，發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎患者中抗-C，抗-NS3陽(yáng)性率較高，分別為73.91%和74.78%，抗-NS4和抗-NS5低于前者，分別為69.56%和63.48%，與文獻(xiàn)報(bào)道8結(jié)果一致。其中發(fā)現(xiàn)一例血清抗-C、抗-NS3、抗-NS4均陰性，而抗-NS5單獨(dú)陽(yáng)性的慢性丙型肝炎患者，占慢性丙型肝炎患者的0.87%。14例HCV感染后

10、115例系列血清，抗-C、抗-NS3、抗-NS4和NS5檢出率分別為83.48%(96/115),81.74%(94/115),65.22%(75/115)和62.61%(72/115)，也表明抗-C、抗-NS3陽(yáng)性率較高?？?C、抗-NS3、抗-NS4和抗NS5在感染一月內(nèi)，陽(yáng)性率分別為84.62%(11/13),84.62%(11/13),30.77%(4/13)和15.38%(2/13)。抗-C，抗-NS3陽(yáng)性率明顯高于抗-NS4和抗-NS5的陽(yáng)性率(P0.01)；感染后三月的陽(yáng)性率分別為91.67%(11/12),83.33%(10/12),66.67%(8/12)和75%(9/12)

11、?？?C陽(yáng)性率明顯高于抗-NS5(P0.01)。表明抗-C、抗-NS3出現(xiàn)早，有早期診斷價(jià)值，而抗-NS5出現(xiàn)晚，無(wú)早期診斷價(jià)值。汪興太等6應(yīng)用NS5區(qū)合成肽檢測(cè)抗-NS5抗體，發(fā)現(xiàn)抗-NS5抗體出現(xiàn)晚，與本文結(jié)果一致。Barrera等9報(bào)道第三代EIA與第二代EIA相比，可提早診斷，抗-NS5有早期診斷價(jià)值，與本文結(jié)果相悖，這可能與包被的NS5抗原以及檢測(cè)的病例不同有關(guān)。此外，我們?cè)贖CV感染后的115份系列血清中，發(fā)現(xiàn)3份血清抗-C、抗-NS3和抗-NS4抗體均陰性，而抗-NS5抗體單獨(dú)陽(yáng)性，占2.6%，說(shuō)明檢測(cè)抗-NS5有重要診斷價(jià)值。測(cè)定14例丙型肝炎系列血清抗-NS5，發(fā)現(xiàn)抗-NS5

12、的動(dòng)態(tài)變化呈4種類(lèi)型，與用合成肽檢測(cè)抗-NS5的結(jié)果一致6。4種類(lèi)型中抗-NS5持續(xù)陽(yáng)性最常見(jiàn)，占42.9%(6/14),持續(xù)陰性占14.3%(2/14)，間斷性陽(yáng)性和一過(guò)性陽(yáng)性各占21.4%(3/14)，見(jiàn)14?？?NS5持續(xù)陰性者，血清ALT輕度升高或正常，而抗-NS5持續(xù)陽(yáng)性者，血清ALT多明顯升高(5/6)，表明抗-NS5可能與肝臟疾病活動(dòng)性有關(guān)，但需今后進(jìn)一步擴(kuò)大病例研究。1HCV感染后血清抗-NS5和ALT的動(dòng)態(tài)變化抗體持續(xù)陽(yáng)性型Fig 1. Dynamics of anti-NS5 and serum ALT after HCV infection2HCV感染后血清抗-NS5和A

13、LT的動(dòng)態(tài)變化抗體持續(xù)陰性型Fig 2. Dynamics of anti-NS5 and serum ALT after HCV infection3HCV感染后血清抗-NS5和ALT的動(dòng)態(tài)變化抗體間斷陽(yáng)性型Fig 3. Dynamics of anti-NS5 and serum ALT after HCV infection4HCV感染后血清抗-NS5和ALT的動(dòng)態(tài)變化抗體一過(guò)性陽(yáng)性型Fig 4. Dynamics of anti-NS5 and serum ALT after HCV infection為了探討NS5重組蛋白用于診斷HCV/1b和HCV/2a的價(jià)值有無(wú)差別，我們用Hae

14、酶切HCV RNA PCR產(chǎn)物對(duì)HCV分型。HCV/型10例，抗-NS5 60%陽(yáng)性，HCV/型30例，抗-NS5 50%陽(yáng)性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，抗-NS5檢出率無(wú)顯著性差異(P0.05)。由于我國(guó)HVC、型罕見(jiàn)，故可認(rèn)為抗-NS5在HCV/1b和HCV/2a中檢出率相近。這與重組NS5分子較大，含HCV型交叉抗原表位有關(guān)。志謝：感謝常綿紅同志在本文成稿中給予的幫助。 本研究屬我國(guó)八五攻關(guān)課題的一部分作者單位:100044 北京醫(yī)科大學(xué)肝病研究所李慶生（現(xiàn)在美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物系作博士后研究)，郭建平， 陶其敏；中國(guó)藥品生物制品檢定所(汪興太, 李河民)參考文獻(xiàn)1Schmilovitz-w

15、eiss H,Levy M,Thompson N,et al.Viral markers in the treatment of hepatitis B and C.Gut,1993,34(Suppl)S26-33.2Nakatsuji Y,Matsumoto A,Tanaka E,et al.Detection of chronic hepatitis C virus infection by four diagnostic system:first-generation and second-generation enzyme-linked immunosorbent assay,seco

16、nd-generation recombinant immunoblot assay and nested polymerase chain reaction analysis.Hepatol, 1992,16300-305.3Callahan JD,Constantine NT,Kataaha P,et al.Second generation hepatitis C virus assays.performance when testion African sera.J Med Virol, 1993,4135-38.4Buffet C,Charnaux N,Laurent-puig P,

17、et al.Enhanced detection of antibodies to hepatitis C virus by use of a third generation recombinant immunoblot assay.J Med Virol,1994,43259-261.5李慶生，郭建平，陶其敏.丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)基因NS5在大腸桿菌中的高效表達(dá).中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，1996，10254-257.6汪興太，李河民，王佑春，等.HCV感染后NS5區(qū)抗體的動(dòng)態(tài)觀察與檢測(cè)意義.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1994，1473-75.7杜紹財(cái)，陶其敏，朱凌，等.丙型肝炎病毒基因5-端非編碼區(qū)酶切分型.中華醫(yī)學(xué)雜志，1993，737.8Lok ASF,Chien D,Choo QL,et al.Antibody response to core,envelope and noustructural hepatitis C virus antigens:Comparison of immunocompetent and immunosuppressed patients.Hep