小鼠肝臟再生早期膽酸代謝相關(guān)基因SHP和Cyp7A1的動(dòng)態(tài)改變

1、    【摘要】  目的探討小鼠肝臟70%切除術(shù)后再生早期,核受體SHP參與調(diào)控Cyp7A1基因表達(dá)的機(jī)制。方法應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝臟70%切除術(shù)后1 h和6 h Cyp7A1基因和SHP基因的表達(dá)。結(jié)果2組肝臟Cyp7A1基因表達(dá)在術(shù)后1 h和6 h明顯降低;SHP基因表達(dá)在術(shù)后1 h顯著上升,術(shù)后6 h急劇下降。結(jié)論小鼠肝臟70%切除術(shù)后再生早期,非依賴FXR的通路參與膽酸介導(dǎo)的Cyp7A1基因轉(zhuǎn)錄的抑制。SHP可通過非FXR介導(dǎo)的途徑參與調(diào)節(jié)Cyp7A1基因的表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】 &

2、#160;肝再生 基因表達(dá) 膽固醇7羥化酶 法尼醇 疾病模型 動(dòng)物    小異二聚體伴侶(small heterodimer partner,SHP)是一種特殊的核受體,它沒有DNA結(jié)合域,主要表達(dá)在肝臟。SHP通過與其他核受體家族成員的相互作用,抑制核受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性1。保持膽酸代謝平衡是維持小鼠肝臟正常再生所必需的重要條件2。Cyp7A1基因編碼經(jīng)典膽酸合成途徑中的限速酶膽固醇7羥化酶(cholesterol 7hydroxylase,Cyp7A1),其調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平。當(dāng)核受體法呢醇受體(farnesoid receptor,FXR)被膽酸激活后,FXR上調(diào)SHP

3、的表達(dá),SHP繼而與核受體肝臟相關(guān)同系物(liver related homologue,LRH)結(jié)合,抑制LRH轉(zhuǎn)錄激活Cyp7A1基因的功能3。FXRSHPLRH參與的通路是膽酸介導(dǎo)的反饋抑制Cyp7A1基因表達(dá)的重要途徑。筆者以小鼠肝臟70%切除為動(dòng)物模型,探討肝臟再生的急性期,SHP是否通過上述途徑參與調(diào)控Cyp7A1基因的表達(dá)。    1材料與方法    1.1動(dòng)物野生型小鼠C57BL/6NCr(美國(guó)National Cancer Institute),FXR基因敲除(FXR-/-)小鼠(美國(guó)Baylor醫(yī)學(xué)院)。    1

4、.2試劑TRI試劑、溴氯丙烷(美國(guó)Molecular Research Center公司),異丙醇、二乙基焦磷酰胺(美國(guó)Sigma公司),MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Invitrogen公司),重組核糖核酸酶抑制劑(美國(guó)Promega公司),SYBRGreen PCR Master Mix(美國(guó)Applied Biosystems公司)。    1.3儀器勻漿器(PTMR2100，美國(guó)Lyophiler/polytron公司),低溫離心機(jī)(CS6R，美國(guó)Beckman公司),分光光度計(jì)(640B，美國(guó)Beckman公司),實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)(7300SYBRGreen，美國(guó)App

5、lied Biosystems公司)。    1.4方法    1.4.1模型制備野生型小鼠和FXR基因敲除(FXR-/-)小鼠均以C57BL/6 NCr為雜交背景。以1212 h晝夜交替作息。標(biāo)準(zhǔn)鼠類食物喂養(yǎng),飲水不限。選擇810周雄性小鼠，每組12只。行70%肝臟切除術(shù)小鼠肝臟左外葉、尾葉和中葉完全切除，保持膽囊完整。術(shù)后1 h、6 h分別處死小鼠，收取肝臟,液氮速凍后保存在-80 冰箱。    1.4.2肝臟總RNA抽提和cDNA合成取肝組織100 mg,在TRI試劑中勻漿,根據(jù)試劑盒方法抽提RNA。取RNA 3 g,以O(shè)lig

6、odT為引物,在反應(yīng)體系20 L 65 預(yù)變性10 min后,加入5×FS緩沖液,0.1 mol/L DTT,25 mmol/L dNTP,Rnasin和MMLV至反應(yīng)體系30 min,42   1 h。    1.4.3實(shí)時(shí)定量PCR應(yīng)用快速實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)定量檢測(cè)肝臟中CYP7A1和SHP mRNA表達(dá)。使用的正向引物(F)和反向引物(R)包括:    CYP7A1(F):CAAGAACCTGTACATGAGGGAC    CYP7A1(R):CACTTCTTCAGAGGCTGCTTTC 

7、   SHP(F):GTCTTTCTGGAGCCTTGAGCTG    SHP(R):GTAGAGGCCATGAGGAGGATTC    actin作為內(nèi)對(duì)照。    1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用twotailed Student's t test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。    2結(jié)果    2.1小鼠肝臟70%切除術(shù)后1 h和6 h,野生型小鼠和FXR/小鼠肝臟Cyp7A1基因表達(dá)均明顯降低(圖1)。    A:野生型小鼠; B:FXR-/-小鼠.   

8、; 圖170%肝臟切除術(shù)后再生早期野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝臟Cyp7A1基因表達(dá)    2.2肝臟70%切除術(shù)后1 h,野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝臟SHP基因表達(dá)均明顯上升(圖2)。    A:野生型小鼠; B:FXR-/-小鼠.    圖270%肝臟切除術(shù)后1 h,野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝臟SHP基因表達(dá)    Fig 2SHP gene expression in the liver of wild type and FXR-/- mice at one hour after 70%hepate

9、ctomy    2.3肝臟70%切除術(shù)后1 h和6 h,野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝臟中SHP基因的表達(dá)均顯著下降(圖3)。    3討論    3.1小鼠肝臟70 %切除術(shù)后再生早期非依賴FXR通路參與抑制膽酸介導(dǎo)Cyp7A1基因轉(zhuǎn)錄肝臟再生過程由許多有機(jī)結(jié)合的階段構(gòu)成,在這個(gè)過程中許多信號(hào)通路被激活4。膽酸主要在肝臟內(nèi)由膽固醇轉(zhuǎn)變而來，除了促進(jìn)脂類食物的吸收,膽酸還是信號(hào)分子,其功能類似于激素5。最近有研究顯示小鼠肝臟的正常再生必需有膽酸信號(hào)的存在。70%肝臟切除術(shù)后所致膽酸堆積不僅促使肝臟通過再生來減輕膽酸的負(fù)荷,而且通過抑

10、制Cyp7A1基因表達(dá)減少膽酸的合成2。    膽酸可通過多種機(jī)制反饋抑制Cyp7A1基因表達(dá)6。膽酸介導(dǎo)的FXRSHPLRH1級(jí)聯(lián)反應(yīng)是Cyp7A1基因轉(zhuǎn)錄抑制的重要方式3。筆者對(duì)野生型小鼠和FXR-/-小鼠行70%肝臟切除術(shù),發(fā)現(xiàn)術(shù)后1 h和6 h,兩組小鼠肝臟Cyp7A1基因表達(dá)均明顯降低，提示在肝臟再生早期,非依賴FXR通路參與抑制膽酸介導(dǎo)的Cyp7A1基因表達(dá)。    3.2小鼠肝臟70%切除術(shù)后再生急性期SHP可通過非FXR介導(dǎo)途徑參與調(diào)節(jié)Cyp7A1基因表達(dá)SHP是核受體超家族的非典型成員,沒有DNA結(jié)合區(qū)域，它可介導(dǎo)許多核受體包括LRH1

11、功能的失活1。本研究顯示，在70%肝臟切除術(shù)后1 h,野生型和FXR-/-小鼠的肝臟SHP mRNA水平都顯著性升高，提示在肝臟再生急性期,SHP可通過非FXR介導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)Cyp7A1基因表達(dá)。cJun N端激酶（JNK）的激活是部分肝臟切除術(shù)后肝臟再生的早期事件7。在小鼠SHP啟動(dòng)子上存在相鄰近的兩個(gè)反應(yīng)元件IR1和AP1，膽酸信號(hào)激活FXR和JNK通路的成員cjun后,分別通過與IR1和AP1結(jié)合促進(jìn)SHP轉(zhuǎn)錄8。因此在肝臟再生急性期,SHP可能通過JNK介導(dǎo)的通路抑制Cyp7A1基因轉(zhuǎn)錄，以使肝臟快速適應(yīng)突然增高的膽酸水平。    3.3SHP可通過自我負(fù)反饋機(jī)制

12、抑制自身的表達(dá)筆者發(fā)現(xiàn)，術(shù)后6 h野生型和FXR-/-小鼠肝臟SHP mRNA水平均明顯下降，可能的原因是之前大量誘導(dǎo)的SHP mRNA表達(dá)導(dǎo)致了SHP自身的負(fù)反饋抑制。因?yàn)镾HP的啟動(dòng)子上具有LRH1結(jié)合位點(diǎn),SHP通過與LRH1相互作用抑制自身表達(dá)。由于SHP是許多核受體的抑制物,SHP自我負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制可以防止因膽酸信號(hào)誘導(dǎo)的SHP過量表達(dá)所致的SHP靶基因的不當(dāng)抑制3,8。    在肝臟70%切除術(shù)后正常再生過程的不同階段,膽酸信號(hào)可能通過不同的分子機(jī)制抑制Cyp7A1基因轉(zhuǎn)錄。在再生急性期,膽酸水平顯著升高,SHP可通過非FXR介導(dǎo)途徑參與快速抑制Cyp7A1基因

13、表達(dá)。在肝臟再生晚期,隨著肝臟體積增大,肝臟功能逐漸恢復(fù),膽酸負(fù)荷減輕,Cyp7A1基因表達(dá)的調(diào)控可能主要通過依賴FXR和SHP途徑實(shí)現(xiàn)。FXRSHPLRH1通路對(duì)膽酸介導(dǎo)的Cyp7A1基因轉(zhuǎn)錄的抑制呈現(xiàn)起效慢、持續(xù)久的特征9。在肝臟再生的不同階段,膽酸信號(hào)通過激活不同通路反饋抑制Cyp7A1基因轉(zhuǎn)錄，這些通路協(xié)調(diào)合作組成一個(gè)精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),對(duì)膽酸信號(hào)的改變做出及時(shí)反應(yīng)。【參考文獻(xiàn)】  1Kalaany N Y,Mangelsdorf D J. LXRS and FXR:The Yin and Yang of cholesterol and fat metabolismJ.

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