大鼠局灶性腦缺血IL-8變化的研究

1、    大鼠局灶性腦缺血IL-8變化的研究        摘要：目的探討IL-8在腦缺血損傷中的變化。方法采用改良Zea Longa線栓法大鼠MCAO模型，將大腦中動脈(MCA)閉塞不同的時間。應用雙抗體夾心間接ELISA法檢測缺血組和對照組大鼠受傷腦組織及血清中IL-8濃度。結果閉塞3h缺血側半球濕重大于非缺血側(P<0.05)，并維持至48h；缺血組腦組織IL-8含量在MCA閉塞3h處于較低水平，隨后逐漸升高，至6h達高峰，隨后又降低；血清中IL-8含量在缺血3h達

2、高峰，隨后緩慢下降?？瞻捉M、假手術組腦組織內IL-8含量高于缺血組(P<0.01)，同一大腦非損傷側高于損傷側。結論IL-8具有雙重作用，既參與腦組織的正常代謝及生理功能，又參與了腦缺血損傷的病理生理過程。關鍵詞：大鼠；腦缺血；細胞因子IL-8中分類號：R743文獻標識碼：A文章編號：1003-2754(2000)04-0221-03 The change of the level of interleukin-8 in focal cerebral ischemia in ratsCAO Qiu-yunPAN Xu-dong（Department of Neurology,The Af

3、filiated Hospital,Qingdao University Medical College,Qingdao 266003）Abstract:ObjectiveTo study the change of the level of interleukin-8(IL-8) in cerebral ischemia injury. MethodsThe middle cerebral artery (MCA) was occluded for different time with modified Zea Longa，s MCAO model. The level of IL-8 i

4、n injured brain tissue and blood serum was detected with double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,both in ischemia group and in control group. ResultsThe weight of the injured brain hemisphere is heavier than that of uninjured hemisphere from 3 hours to 48 hours after cerebral isch

5、emia(P<0.05). The content of IL-8 in injured brain tissue was in lower level at 3 hours after ischemia,and then increased,peaked at 6 hours,and then decreased. The concentration of IL-8 in serum peaked at 3 hours after ischemia,and then decreased slowly. The content of IL-8 in brain tissue of con

6、trol group was higher than that in ischemia group (P<0.01). ConclusionIL-8 has double roles it play a role in metabolism and function in normal brain tissue and a role in pathophysiological course of cerebral ischemia injury.Key words:Rat;Cerebral ischemia;Cytokine;IL-8白細胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)

7、是一種炎性趨化因子，對中性粒細胞具有趨化和激活作用。腦缺血損傷可產生完整的炎性反應，誘導細胞因子的表達。目前，細胞因子在腦缺血損傷中的作用已有不少報道，而IL-8在腦缺血損傷中的作用報道不多。作者就IL-8在腦缺血損傷中的作用進行了探討。1材料與方法1.1實驗動物及分組健康成年Wistar大鼠，清潔級，共56只，體重250±30g，雌雄不限，由青島市實驗動物中心提供。隨機分為：(1)空白組(n=8);(2)假手術對照組(n=8)；(3)缺血組：MCA分別閉塞3、6、12、24、48h，每個時間點8只。1.2栓線制備取4-0單股尼龍線50mm,直徑0.2mm，將頭端0.5mm加熱成光滑

8、球形，在光鏡下呈光滑圓球，于線端18.5mm處作標記，75%酒精清潔后置肝素化生理鹽水中備用。1.3動物模型制備將大鼠以3.6%水合氯醛(360mg/kg體重)腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術臺上，取頸部正中切口，鈍性分離甲狀腺，將其上翻并加以保護，分離右側頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸外動脈(external carotid artery,ECA)和頸內動脈(internal carotid artery,ICA)，結扎ECA和CCA近心端，于CCA遠心端備線，于ICA置一動脈夾，參照改良Zea Longa方法1，2，于CCA近分叉處剪一約0.2mm的“V”字

9、形切口，插入栓線，插入深度18.5mm±0.5mm，使栓線進入ICA，越過MCA開口處，到達大腦前動脈(anterior cerebral artery,ACA)起始部，阻斷MCA的所有血液來源，扎緊備線，甲狀腺復位，關閉并縫合皮膚切口，栓線外留約1cm。缺血組大鼠將大腦中動脈(middle cerebral artery,MCA)分別閉塞3、6、12、24、48h。假手術組手術過程同前，將栓線插入1min拔出。術中室溫保持在25，術后大鼠保溫。1.4檢測指標及方法1.4.1標本收集每只模型成功的大鼠在規(guī)定的時間點過度麻醉，開胸暴露心臟、自右心房取血2ml，37.4孵育3小時，然后2

10、000r/min離心，分離血清，封存，置 -20 冰箱待測； 同時， 依次用 0.85%生理鹽水及4%多聚甲醛各200ml作心臟灌注，固定。斷頭取腦，用電子秤稱腦重量，分開兩半球，分別稱重，距額極2.5mm處向后切取2.5mm腦組織，稱重，按0.1g1ml的比例加4%多聚甲醛作腦組織勻漿，2000r/min離心，取上清，封存，置-20冰箱待測。1.4.2IL-8的測定IL-8的測定采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)，ELISA藥盒購自美國Genzyme公司特許分裝的深圳晶美生物工程有限公司，由專人嚴重按藥盒說明書進行操

11、作。1.5統(tǒng)計學方法應用PEMS 2.1軟件包行方差分析，q檢驗，t檢驗。2結果2.1腦缺血損傷后左右大腦半球重量比較，見表1。表1腦缺血左右大腦半球重量比較(±s,g)左半球右半球空白組假手術組缺血3h缺血6h缺血12h缺血24h缺血48h0.82±0.070.85±0.110.78±0.100.86±0.050.82±0.090.85±0.070.80±0.070.85±0.050.79±0.070.87±0.08*0.91±0.09*0.89±0.10*0.9

12、2±0.07*0.89±0.09*與左側大腦半球重量比較(采用配對t檢驗)，*P<0.05,*P<0.01 2.2腦缺血損傷后受損腦組織及血清IL-8含量變化，見表2。表2腦缺血后受損腦組織和血清IL-8含量變化(±s)腦組織(pg/g)血清(pg/ml)空白組假手術組缺血3h缺血6h缺血12h缺血24h缺血48h10.41±1.8312.83±3.214.58±1.37*6.19±1.25*5.78±1.80*5.72±1.47*4.13±0.74*1.56±0.371.

13、84±0.483.61±0.81*2.67±0.22*2.69±0.39*2.68±0.71*2.33±0.70*各實驗組與空白對照組比較*P<0.01 3討論3.1腦缺血后受損腦組織和血清中IL-8含量的改變呈時間依賴性。Liu等研究發(fā)現(xiàn)3，大鼠MCAO后6h，在缺血皮層可見CINC(cytokine-induced neutrophil chemoattractant,相當于IL-8)mRNA升高，12h達高峰，24h后降低。原位雜交發(fā)現(xiàn)4，大鼠持續(xù)MCAO后15min有IL-1 mRNA的明顯表達，3h達高峰，4d內逐漸消

14、失，1h出現(xiàn)TNF-mRNA的表達，612h達高峰，12d內逐漸降低。IL-1和TNF-均為誘導產生IL-8的細胞因子5。本實驗發(fā)現(xiàn)MCAO后，MCA供血區(qū)腦組織IL-8含量，在3h處于較低水平，隨后逐漸上升，6h達高峰，然后緩慢下降。其產生晚于IL-1和TNF-。說明腦缺血后，能量的缺乏，興奮性氨基酸的釋放，致使鈣內流、細胞內鈣庫釋放，激活大量的酶，使氧自由基的產生增加，進一步激活炎性細胞因子和IL-1和TNF-和TGF-等。IL-1和TNF等進一步誘導IL-8的產生使IL-8的水平增加。而TGF-可抑制星形膠質細胞產生TNF-6，另外，尚有內源性控制系統(tǒng)產生的細胞因子抑制，導致IL-8的水

15、平再度降低。3.2腦缺血時，腦細胞的無氧呼吸數(shù)分鐘，即由于儲備能量的耗竭而誘發(fā)酸中毒和能量型離子泵功能喪失。Na+-K+ATP酶的轉運障礙引起細胞腫脹和細胞毒性水腫。本實驗發(fā)現(xiàn)缺血3h，大腦半球重量損傷側開始大于非損傷側，大腦右半球重量開始大于左半球(P<0.05)，6h時明顯，持續(xù)到24h、48h后水腫程度減輕，仍重于左半球(P<0.05)，與腦組織IL-8含量變化時相基本一致。3.3IL-8被發(fā)現(xiàn)以來，一直以炎癥趨化因子的身份存在。很多作者認為趨化細胞因子在正常細胞中不表達，通過研究認為腦膠質細胞可以表達CINC，在缺血6h出現(xiàn)過度表達，12h時達高峰。本實驗經過反復實驗，并設

16、空白對照組、假手術對照組及自身對照，發(fā)現(xiàn)空白組、假手術組腦組織內IL-8含量高于腦缺血組(P<0.01)，腦缺血組非損傷側腦組織IL-8含量高于損傷側(P<0.05)。說明正常腦組織可以合成并釋放一定數(shù)量的IL-8。筆者認為，正常腦組織IL-8含量高于受損腦組織，以及腦組織和血清中IL-8水平在腦缺血損傷中上升及下降的時相不一致表明，IL-8的產生及作用存在差異：其一為腦源性IL-8，參與正常腦組織的代謝和功能；其二為外周性IL-8，主要由內皮細胞、中性粒細胞、單核細胞等產生，參與炎癥反應過程。以上結果可能是，正常腦組織產生一定量的IL-8，在缺血損傷的情況下，腦源性的IL-8產生

17、受到抑制，使受損區(qū)腦組織的IL-8含量驟然下降。隨后由缺血損傷導致炎癥反應，產生炎癥細胞因子，如IL-1、TNF- Et-17等，這些細胞因子誘導內皮細胞、單核細胞和中性粒細胞等產生IL-8，主要起炎癥趨化作用，吸引中性粒細胞到達損傷區(qū)，加重該區(qū)域的損傷。隨著炎癥的發(fā)展，調動自身控制系統(tǒng)及細胞因子的抑制，致使炎癥反應所產生的IL-8逐漸降低。總之，IL-8可能存在雙重作用，正常腦組織可以產生起生理作用的IL-8。腦缺血損傷后，炎癥反應時可產生起炎性趨化作用的IL-8。所以，如果在適當?shù)臅r間給予對抗IL-8的藥物，抑制參與腦缺血損傷的IL-8，預計可以改善腦缺血損傷的預后。作者單位：曹秋云（青島

18、大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經科，山東 青島 266003）潘旭東（青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經科，山東 青島 266003）參考文獻：1Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in ratsJ. Stroke,1989,20:84-91.2王春霞，劉春風，包士堯. 大鼠局灶腦缺血再灌注模型改良后的實驗研究J. 蘇州醫(yī)學院學報，1999，19：124-125.3Liu T,Young RP,Mc Donnell PC,et al. Cytokine-induced neurophil chemoattractant mRNA expressed in cerebral ischemiaJ. Neurosci Lett,1993,164:125-128.4Buttini M,Sauter A,Boddeke HW. Induction of interleukin-1 beta mRNA after focal cerebral ischemia in the ratJ. Brain Res M