細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的誘變和篩選鑒定論文

1、 細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的誘變和篩選鑒定XXX ( 生命科學(xué)學(xué)院,淄博 255000 )摘要: 實(shí)驗(yàn)采用物理誘變非電離輻射紫外線（15W）為誘變劑，來對(duì)大腸桿菌誘發(fā)突變，并用抗青霉素法淘汰野生型（富集營(yíng)養(yǎng)缺陷型），采用點(diǎn)植對(duì)照法檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型，得到一株?duì)I養(yǎng)缺陷性菌。最后經(jīng)生長(zhǎng)譜法鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株為絲氨酸（ser）缺陷型。關(guān)鍵詞：大腸桿菌誘變 營(yíng)養(yǎng)缺陷性 紫外線誘變Mutagenesis and screening identification of bacteria auxotrophic strainsXXX(College of Life Science, Zibo 255000)Summa

2、ry: This experiment, the UV (15W) as mutagenic agent, to the E. coli induced mutation, and out of the wild-type (with penicillin method concentrated auxotrophic) to control method detection dot explants defect type, a bacteria 110 #. Final growth SPECTROMETRY identification auxotrophic strains Ser (

3、tryptophan) auxotrophic.Keywords: E. coli UV induced auxotroph實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私鉅I(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株選育的原理。 學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的誘變、篩選與鑒定方法。 實(shí)驗(yàn)原理：營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化學(xué)因素處理， 使編碼合成 代謝途徑中某些酶的基因突變，喪失了合成某些代謝產(chǎn)物(如氨基酸、維生素)的能力，必須在基本培養(yǎng)基中補(bǔ)充該種營(yíng)養(yǎng)成分，才能正常生長(zhǎng)的一類 突變株。這類菌株可以通過降低或消除末端產(chǎn)物濃度，在代謝控制中解除反饋抑 制或阻遏，而使代謝途徑中間產(chǎn)物或分支合成途徑中末端產(chǎn)物積累。在氨基酸、 核苷酸生產(chǎn)中已廣泛

4、使用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株；也可用于遺傳學(xué)分析、微生物代謝途徑的研究及細(xì)胞和分子水平基因重組研究中作為供體和受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記。營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選一般分四個(gè)環(huán)節(jié)，即誘變劑處理、營(yíng)養(yǎng)缺陷型濃縮、檢出和鑒定。誘變處理突變頻率較低，只有通過淘汰野生型，才能濃縮營(yíng)養(yǎng)缺陷型而選 出少數(shù)突變抹。濃縮營(yíng)養(yǎng)缺陷型有青霉素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和饑餓法 四種。檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型也有逐個(gè)測(cè)定法、影印培養(yǎng)法、夾層培養(yǎng)法和限量補(bǔ)給法 四種。鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷型一般采用生長(zhǎng)譜法。本實(shí)驗(yàn)選用紫外線為誘變劑，來誘發(fā)突變，并用青霉素法淘汰野生型，逐個(gè)測(cè)定法檢出缺陷型，最后經(jīng)生長(zhǎng)譜法鑒定細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。一、材料與方法1.1材料1.1.1菌種：

5、大腸桿菌（E.coli）1.1.2培養(yǎng)基： LB培養(yǎng)液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121滅菌15min 2×LB培養(yǎng)液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，50ml，pH7.2 121滅菌15min 基本培養(yǎng)基： 葡萄糖 0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，檸檬酸鈉 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水100 mL，pH 7.2，110滅菌 20 min。 配固體培養(yǎng)基時(shí)需加 2%洗滌處理過的瓊脂。無N基本液體培養(yǎng)基：K2H

6、PO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 檸檬酸鈉 3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; 葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110滅菌20min2N基本培養(yǎng)基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 檸檬酸鈉 3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; (NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110滅菌20min完全培養(yǎng)基同LB培養(yǎng)基，配置固體培養(yǎng)基，需加 2%的瓊脂。1.1.3混合氨基酸和混合維生素21.2方法1.2.1誘變處理1th day，接種：取一環(huán)E.coli于5mlLB液體三角瓶中，37培養(yǎng)過夜。2th da

7、y，誘變：早上添加5mlLB液，繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)，取5ml菌液與離心管中，離心（3500rpm）10分鐘（注意配平，相對(duì)兩管相差不超過0.01g），棄上清，加生理鹽水5ml，打勻沉淀，吸菌液3ml于75mm培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)皿置于15W紫外燈下30cm處（處理前紫外燈預(yù)熱30min），將培養(yǎng)皿連同蓋一起置于15W紫外燈下滅菌1min，然后打開皿蓋搖床照射（1min、2min、3min、4min），照射后先蓋上皿蓋再關(guān)燈。吸3ml 2倍LB液加入處理過的菌液平皿內(nèi)，混勻，用黑布（紙）包好，置37避光培養(yǎng)12h以上。1.2.2營(yíng)養(yǎng)缺陷型濃縮（淘汰野生型）3th day，延遲處理：吸菌液5ml于離心管中

8、，3500rpm離心10min，棄上清。離心洗滌兩次（加生理鹽水至原體積，打勻沉淀，離心，棄上清，重復(fù)一次），最后加生理鹽水制成5ml菌懸液。取0.1ml菌液于5ml無N培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)12h。（消耗體內(nèi)的N素，使停止生長(zhǎng)，避免缺陷型被以后加入的青霉素殺死）4th day，初篩：按1:1比例加入2N基本培養(yǎng)液5ml，加5萬U/ml青霉素鈉鹽溶液100ul，使青霉素在溶液中的最終濃度約為500U/ml，再放入37培養(yǎng)。（野生型利用氮大量生長(zhǎng)，細(xì)胞壁不能完整合成而死亡。缺陷型因不長(zhǎng)避免被殺死）。5th day，從培養(yǎng)24小時(shí)的菌液中分別取0.1ml菌液到基本及完全培養(yǎng)基兩個(gè)培養(yǎng)皿中，涂布，37培

9、養(yǎng)。1.2.3營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢出7th day，檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型。上述平板培養(yǎng)3648h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。選取完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)的菌落數(shù)大大超過基本培養(yǎng)基的那一組，用滅菌牙簽挑取完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的 菌落100個(gè)分別點(diǎn)種于基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上（先基本，后完全），37培養(yǎng)。9th day，選在基本培養(yǎng)基上不長(zhǎng)，完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落在基本培養(yǎng)基上劃線，37培養(yǎng)24h，仍不長(zhǎng)的是營(yíng)養(yǎng)缺陷型。 圖1基本培養(yǎng)基 圖2完全培養(yǎng)基1.2.4營(yíng)養(yǎng)缺陷型鑒定10th day，生長(zhǎng)譜的測(cè)定：將檢出的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌落接種于5ml LB液試管中，37培養(yǎng)1416h。11th day，培養(yǎng)16h的菌液離心。3500rpm，10

10、min，棄上清，加生理鹽水，打勻沉淀，再次離心。加5ml生理鹽水制成菌懸液。取其1ml于培養(yǎng)皿中，加入融化后冷卻到4050的基本培養(yǎng)基，混勻，平放，共二皿。（平板表面分別沾上沾有混合氨基酸(或酪素水解液)的濾紙片，30培養(yǎng) 24h，經(jīng)培養(yǎng)后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)周圍有生長(zhǎng)圈，即表明為氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株）。將皿底分成分格用接種環(huán)依次放入少許混合氨基酸等，如圖1.37培養(yǎng)24h，觀察生長(zhǎng)情況，確定是哪種氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。如圖1.37培養(yǎng)24h，觀察生長(zhǎng)情況，確定是哪種氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。葉：葉酸 啶：嘧啶B:B組維生素（B1.B2.B6.煙酰胺.泛酸鈣）腺：腺嘌呤1.2.3.4.5：均為氨基酸組合223451

11、·腺B啶 葉酸酸二、結(jié)果與分析2.1 營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢出點(diǎn)植對(duì)照時(shí)每平皿點(diǎn)36株菌，培養(yǎng)12h后基本培養(yǎng)基只有100#菌沒有長(zhǎng)出，之后將100#劃線到基本培養(yǎng)基后仍無菌生長(zhǎng)，即100#為營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。 本實(shí)驗(yàn)將已鑒定出的一株100#營(yíng)養(yǎng)缺陷性菌株作為對(duì)照。2.2 營(yíng)養(yǎng)缺陷型鑒定 圖4 可以明顯看出圖4中2號(hào)和5號(hào)濾紙片周圍有生長(zhǎng)圈。三、結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)選用紫外線（15W）為誘變劑，來對(duì)大腸桿菌誘發(fā)突變，并用青霉素法淘汰野生型，采用點(diǎn)植對(duì)照檢出缺陷型，得到100#一株菌。最后經(jīng)生長(zhǎng)譜法鑒定細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型為Ser（色氨酸）缺陷型。四、討論4.1.本試驗(yàn)結(jié)果誘變率較低，其原因可能如下： （1）本次實(shí)驗(yàn)時(shí)所誘變的大腸桿菌劑量較小。 （2）在紫外燈照射后，黑暗培養(yǎng)不標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)致光復(fù)活作用。 （3）在對(duì)紫外燈的照射時(shí)間上把握不恰當(dāng)，導(dǎo)致誘變率低。4.2問題改進(jìn)：（1） 注意紫外燈的照射時(shí)間，把菌種分成幾組分別在紫外燈下照射不同的時(shí)間，實(shí)驗(yàn)后選出最佳照射時(shí)間，為下次試驗(yàn)留作參考。（2） 將誘變后的菌體進(jìn)行后培養(yǎng)，保證其誘變效果。參考文獻(xiàn)1唐高霞，賽鴻斌 ，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的應(yīng)用，今日科技，1991，8；32施