醫(yī)學分子生物學技術蛋白質.

1、2013-7-27第一章 蛋白質的分離與純化第一節(jié)蛋勺質分富純化的一般原則一、基勺質小富純化技術及其依據(jù)表11主要的蛋白質分離純化方法及依據(jù)兀盧性質分離方法分/人小與形狀 超濾、透析、密度梯度離心、凝膠過濾層析、凝膠電泳溶解度沉淀法、相分配法.分配層析.結品、溶劑抽捉、逆流分配電荷分布電泳技術、等電點沉淀、離子交換層析、聚焦層析、等電聚倍數(shù)電泳生物功能專-性親和層析疏水性201-7-27疏水作用層析.反相高效液相層析2第一章 蛋白質的分離與純化二、蛋勺質純化的一般段計原則1 目的蛋勺的分富和純化應該盡可能 選擇來源方便、成本低、易操作的組織 或細胞作為原料；2. 要建立一個特異、快速.可重復.

2、 經(jīng)濟的目的蛋勺活性檢測方法；3. 蛋勺質分離純化工藝的設計應該分 級分禽、丸粗后細的原則；4. 純化條件要盡可能溫和。2013-7-273第一章 蛋白質的分離與純化第二節(jié) 蛋勺質 的層析(chromatography) 分禽一、層析技術的發(fā)畏簡史及科學意義二、層析技術的基本原理固定相：在層析糸統(tǒng)分富過程中靜止不 動的相。流動相：在層析糸統(tǒng)分富過程中在我體 上延一定方向移動的相。2013-7-274ReservoirSolution nwbilc pliase I iSolid porous matrix tutioruiry phasl PorouB 8upp<jH2013-7-275

3、煤板理論：（溶質在固定相中的濃度） CsK=（溶質在流動相中的濃度） Cm把色譜柱比作一個精憎塔，沿用精憎塔中 塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行 為，同時引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率 的指標，即色譜柱是由一系列連續(xù)的、和 等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度用 H表不，稱為塔板咼丿艾，簡稱板咼。2013-7-277塔板理論假設：1 在柱內一小段長度H內，組分口J以在兩 相間迅速達到平衡。這一小段柱長稱為 理論塔板高度H。2. 以氣相色譜為例，載氣進入色譜柱不 是連續(xù)進行的，而是脈動式，每次進氣 為一個塔板體積（） O3. 所有組分開始時存在于第0號塔板上， 而且試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。4

4、分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組 分在某一塔板上的量無關。2013-7-278簡單地認為：在毎一塊煤板上，滾質 在兩相間很快達到分配平衡，然后隨 著流動才目按一個一個煤板的方式向前 移動。對于一根長為L的色譜柱，濟 質平衡的次數(shù)應為：n = L/Hn稱為理論塚板教。與精錮煤一樣， 色譜柱的柱效隨理論煤板數(shù)n的增加 而增加，隨板當H的增大而減小。2013-7-276464"1十上和轉移 11641216"T"40750252013-7-270190 060-2536G75 |2025|2025| 2 25 |675| 675|2727卩01 | 202 | 152

5、I 11 LKJ LKJ20.3103.013S27裳逆A拓W 套E»填去2 口陣«恭 3 鉛IdX董 42013,7,27耳6464 -32 064 -6 一 -】6 _0 032 32 一一和_-廠一二6 一 - 8 一16 32 16 一-LI - " 4 _-二-H-" 一 -一8 24 24 8 fl B B B一 2一 8匚 2Ll00I一 nussF+UsfcO管中溶質的總疑層析的展開方式洗脫法也稱沖洗法。工作肘，首丸將 樣品加列色譜柱頭上，然后用吸附或 溶蟹能力比試J樣組分弱得多的氣體或 液體作沖洗利。由于各組分在固定相 上的吸附或溶解能

6、力不同，菠沖洗劑 帶出的丸后次厚也不同，從而使組分 彼此分富。流出曲線下圖。2013-7-27132013-7-27142013-7-27#頂替法是將樣品加到色譜柱頭后，在惰性流動相中加人對定相的吸附或2013-7-27#滋解能力比所有試樣組分強的楊質為 頂棒劑或直接用頂棒和作流動相丿, 通過色譜柱，將各組分按吸附或嫁解 能力的強弱順厚，傢次頂棒出固走相。很朗顯，浹附或溶解能力最弱的組分 最丸流出，最強的最后流出。頂替法 的流出曲線如下圖。2013-7-27#2013-7-2716152013-7-27迎頭法是將試樣混合湯決續(xù)通過色譜 柱，吸附或溶蟹能力最弱的組分首先 一純物質的狀態(tài)流出，其次

7、則以第一 組分和浹附或涿解能力較弱的第二組 分混合物，以此類推。流出曲線如下 圖OAA+B2013-7-27#層析流出曲線及相關術語色譜流出曲線和色譜蜂由檢測彖輸出的電信號強度對 肘間作圖，所得曲線稱為色譜流蟲曲 線。曲線上突起部分就是色譜蜂。如果進樣量很小，濃度很低， 在吸附等溫線（宅固吸附色譜丿或分 配等溫線宅液分配色譜丿的線性范 圍內，則色譜蜂是對稱的。2013-7-2717基線在實殮襟作條件下，色譜柱后 沒有樣品組分流出時的流出曲線稱為 基線，穩(wěn)定的基線應該是一條水平直 線。色譜蜂頂點與基線之問的垂直距 離,y人ChJ表示。2013-7-2718進樣空氣峰色譜峰色譜流出曲線色譜流沖曲線

8、和色譜峰基線(a)峰高(h)2013-7-27死時間519不閩SI定相吸附或溶解的物質進入色譜柱時，從進樣 到出現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間，它止比于色譜柱 的空隙體積，如下圖。E樣AA to因為這種物質不被固定相吸附或溶解，故其流動速度將與 流動相流動速度相近。測定流動相平均線速口時，可用柱長 L與t0的比值計算，即u = L/tO2013-7-27202 保留時間tr試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經(jīng)過的時間, 稱為保留時間，如下圖。2013-7-27222013-7-27#212013-7-273調整保留時間某組分的保留時向扣除死時間后，稱為該組分的調整保留 時間，即 t/= tr-t

9、0ill于組分在色譜柱屮的保留時間包含了組分隨流動相通 過柱子所須的時間和組分在固定相屮滯留所須的時間，所 以實際上是組分在固定相中保留的總時間。保留時間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組分的保留時 間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留 體積來表示保留值。2013-7-27#4.死體積V"指色譜柱在填充后，柱管內固定相顆粒間所剩留的空 間、色譜儀屮管路和連接頭間的空間以及檢次'J器的空間的 總和。當后兩相很小可忽略不計時，死體積可由死時間與 色譜柱出口的載氣流速巴。（cn?.min"）計算。V（）= t（）F co式中F®為扣除飽和水蒸氣壓并經(jīng)

10、溫度校正的流速。僅適用于氣相色譜，不適用于液相色譜。232013-7-275保留體積V指從進樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所 通過的流動相的體積。保留時間與保留體積關系：Vr= tr Fco6調整保留體積Vr，某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調整 保留體積。Vr' = vr-vo= t/ Fco2013-7-2724某組分2的麻保留值與組分1的調整保留值之比，稱 削為相對保留值。r2j= t J / 咕=Vn，/ Vrf由于相對保留值只與柱溫及固定相性質有關，而與柱 徑、柱長、填充情況及流動相流速無關，因此，它在色譜 法屮，特別是在氣相色譜法屮，廣泛用作定性的依據(jù)。2

11、013-7-2725在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標弁(S), 然后再求其它峰(i)對這個峰的相對保留值，此時可用 符號a表示，即i(!a = t/(i)/t/ (s)式中t/(i)為后出峰的調整保留時間，所以oc總是人于1 的。相對保留值往往可作為衡量固定相選擇性的指標，又 稱選擇因子。區(qū)域寬度色譜峰的區(qū)域寬度是色譜流岀曲線的重要參數(shù)之一， 用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動力學因素。表示 色譜峰區(qū)域寬度通常有三種方法。1. 標準偏差b即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。2. 半峰寬Wi/2即峰高一半處對應的峰寬。它與標準偏差的關系為Wi/2=2.354q3峰底寬度W即色譜峰兩側拐點

12、上的切線在基線上截距間的距離。 它與標準偏差b的關系是 W = 4c272013-7-27 2013-7-2728從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：(i) 根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個數(shù);(ii) 根據(jù)色譜峰的保留值，可以進行定性分析；(iii) 根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進行定量分析；(iv) 色譜峰的保留值及其區(qū)域寬度，是評價色譜柱分離效能 的依據(jù)；(V)色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相(或流動相)選擇 是否合適的依據(jù)。2013-7-2729三、富子交換層析青子交換層析(ion exchange chromatography)牙9用 物質的 赴荷與 層析我體(富子交

13、換劑)電荷之間的相 互作用達到分離純化的目的的星析 方法稱離子交換層析。富子交換利：富子交換星析所用的 固相基質，由不滾于水的、具有網(wǎng) 狀結物的嵩分子聚合腸組成。2013-7-27312013-7-27Polymer IxuiUh with negatively rharciM Aini'tlonal groupsProtcbi mixture is added to culuiiui conlaixiiuK cMinn exdiarrs.Key: nirt. pMitivc diaic.Net positive chATtfv Zt JiRKMiva chr Lxi |；e netd

14、iarvPmteiiiF mevvt through ! h*<column at rate« determinedby thmr nt?i dlarge at thbpli bcuij; Ubcd. Witlj c:aiiuugchagm. proleing withu more negative n(< clittfciikav tastui and dul<? earLur.31w子交換層析的操作1、樣 w的準備:固體樣品必須6蓉于適當富子強度和pH的緩沖液中。組 織液或細胞裂解液用緩沖液稀釋后 可直接上柱。鹽析樣為必須除鹽后才能進行分富O2、爲子交換劑的處理

15、：根據(jù)菠分富 樣品的性質選擇合適的富子交換劑, 離子交換劑在使用前須先進行處理。2013-7-27333、層析柱的準務：富子交換層析柱 一般選擇粗短柱為宜，使得樣品在分 富的同肘進行濃縮。富子交換劑的用 量根據(jù)樣品量和交換劑的交換彖量確 定 O4、樣昌分富：上樣量的多少與目的 蛋自的性質、濃度及交換劑的親和力 有關。在分靂過程中，應注意A2013-7-271J樣為的濃度不宜過大332J滾解蛋勺質樣品的緩沖液的富子強度要低于起始緩沖液3丿上樣速度不要過快4丿上樣緩沖液的pH應合適5、洗脫2013-7-27346、洗脫液的鑒定和回收7、富子交換劑的再生與儲存州 |<I n 1-eiH州 |&

16、lt;I n 1-eiH2013-7-2735州 |<I n 1-eiH天掄粉各成分 用特種雷子交 換劑層析分富392013-7-27392013-7-27402013-7-2742二、分子篩原理2013-7-27#2013-7-27#2013-7-27#2013-7-27#凝膠層析原理圖2013-7-27#2013-7-27#SihmII molrciilrIjargc moire tileEludon columnImkU=.x=-=r.ns乙三 2OJdVolume (mt.)2013-7-2743加樣兒斤始洗脫IIIII432013-7-27凝膠過濾的分配糸數(shù)(Ve-VO)(Vi

17、)2013-7-2745主要凝膠過濾介質的牌號及骨架結構«號件架類型生產飆位備注Sephadex.KmeTHham Pharmacia< 瑙典衍生產品Sephadex HLSephasorb HP系列產品Sepharcwc CLSepharoseAmershani lharmaciaSepharose FFSu peruseBio Gel A瓊脂*litoRad （ 國Superdex瓊脂梢爸聚期Anwrham Pharm-ariaBio-Gel P聚丙烯航胺Bto-RadSeplucryl««« «丙饒醴Amersham Pharmac

18、ia改進產品Sephacryl HRSephacryl SFEupergit C聚丙墀般鞍系德國件架內含有環(huán)代松Toyopearl聚乙X傅系TosoHahs （ H 本）Bio-BeadsS-X聚萃乙烯系Bio Rad2013-7-2745葡聚糖凝膠（G）型號分離范圍（分子量）吸水量 （克/克 干凝膠）膨脹體積（亳升/ 克干凝膠）浸泡時間蛋白質多糖2025 c90 100 c10<700<7001.02-33115<1500<15001.52.5-3.531251000-5000100-50002.54-631501500-30000500-100005.09-1131753000-700001000-500007.512-152431004000-1500001000-1000001015-207251505000-4000001000-1500001520-307252005000-8000001000-2000002030-40725親和層析：利用生揚分子間特殊的親 和關糸進行的分富方凍。是蛋勺質分 W純化的最有放的方弘之一，有肘甚 至可以僅用一步