醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)

1、醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解電泳儀的結(jié)構(gòu)及工作原理2. 初步掌握電泳儀的基本操作。3. 了解常用的蛋白質(zhì)顯色方法。實(shí)驗(yàn)器材醋酸纖維薄膜，pH8.6巴比妥緩沖液：稱(chēng)取巴比妥鈉10.30g，巴比妥1.84g，溶于1000ml蒸餾水中，或者稱(chēng)取10.3g巴比妥鈉，加1mol/L鹽酸8ml，加蒸餾水至1000ml。 染色液：氨基黑10B1g溶于10ml冰醋酸與90ml甲醇的混合液中。 洗滌液：冰醋酸10ml加甲醇90ml,或者甲醇50ml，冰醋酸10ml加蒸餾水40ml. 透明液：甘油溶液，或用苯甲醇，水楊酸甲醇等溶液。 微量注射器，蛋白質(zhì)樣品液和電泳儀一臺(tái)。實(shí)驗(yàn)原理以醇酸纖維等制成薄膜作為

2、支持體的電泳儀稱(chēng)為薄膜電泳。在一定酸堿度條件下，蛋白質(zhì)分子由于基團(tuán)電離而帶有一定的電荷，在含有緩沖液的薄膜上，受電場(chǎng)力作用以一定的速度向一定的方向移動(dòng)。不同的蛋白質(zhì)分子，由于所帶電荷的不同，移動(dòng)的速度和方向也不同，從而達(dá)到分離。這種薄膜對(duì)蛋白質(zhì)樣品的吸附作用小，幾乎完全消除紙蛋白質(zhì)電泳中出現(xiàn)的拖尾現(xiàn)象，又因?yàn)楸∧さ挠H屬性比較小，它所容納的緩沖液也少。電泳是的電流大部分是樣品在傳導(dǎo)，因此具有簡(jiǎn)單，快速，區(qū)帶清晰，靈敏度高，易于定量和便于保存的特點(diǎn)。本方法樣品用量少，5ug的蛋白質(zhì)就能得到滿(mǎn)意的結(jié)果。因此特別適合于病理情況下微量蛋白檢測(cè)。以廣泛用于蛋白質(zhì)和同工酶的分離分析，也可以用于免疫電泳等方面

3、。實(shí)驗(yàn)步驟1醋酸纖維薄膜的準(zhǔn)備將醋酸纖維薄膜切成10cm*2.5cm的膜條，用鑷子夾住緩慢放入巴比妥緩沖液中30分鐘，充分浸透，取出用濾紙吸去多余的緩沖液。2點(diǎn)樣用微量吸管將5ug但白字樣品點(diǎn)在薄膜中英。3電泳儀濕潤(rùn)的薄膜條置于電泳儀的長(zhǎng)條架子上，薄膜條兩端與濾紙相接觸，拉直膜條，將濾紙條的另一端浸入緩沖液中，緩沖液兩槽的液面要水平，以避免虹吸現(xiàn)象。加蓋密封，注意防止緩沖液蒸發(fā)并避免水滴落在膜條上。靜止10分鐘。接通電源開(kāi)始電泳，調(diào)節(jié)好電壓使之穩(wěn)定，以20mv/cm的電場(chǎng)強(qiáng)度電泳1小時(shí)左右。4. 顯色 電泳完畢后，取出膜條，用溴酚藍(lán)顯色法或者氨黑10B顯色法處理，取出膜條后浸入氨基黑染液中染色

4、510分鐘，然后用漂洗液洗5分鐘，直到區(qū)帶清晰為止。若要保存圖譜或使用分光光度計(jì)直接測(cè)定，則可在膜條染色后，洗褪底色，完全干燥后，置于透明液中5分鐘，取出，干后即可。思考題1醋酸纖維薄膜的特點(diǎn)及使用場(chǎng)合。2簡(jiǎn)述醋酸纖維薄膜電泳原理。 3電泳操作時(shí)應(yīng)該注意哪些問(wèn)題？注意事項(xiàng)1、醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理 市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的重要關(guān)鍵之一。將干膜片漂浮于電極緩沖液表面，其目的是選擇膜片厚薄及均勻度，如漂浮15s30s時(shí)，膜片吸水不均勻，則有白斑點(diǎn)或條紋，這提示膜片厚薄不勻，應(yīng)舍去不用，以免造成電泳后區(qū)帶扭曲，界線不清，背景脫色困難，結(jié)果難以重復(fù)。由于醋酸纖維薄膜親

5、水性比紙小，浸泡30min以上是保證膜片上有一定量的緩沖液，并使其恢復(fù)到原來(lái)多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。最好是讓漂浮于緩沖液的薄膜吸滿(mǎn)緩沖液后自然下沉，這樣可將膜片上聚集的小氣泡趕著走。點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將膜片表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免緩沖液太多引起樣品擴(kuò)散。但也不能吸得太干，太干則樣品不易進(jìn)入薄膜的網(wǎng)孔內(nèi)，而造成電泳起始點(diǎn)參差不齊，影響分離效果。吸水量以不干不濕為宜。為防止指紋感染，取膜時(shí)，應(yīng)戴指套或用鑷子。 2、緩沖液的選擇 醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6巴比妥溶液，其濃度為0.05mol/L0.09mol/L。選擇何種濃度與樣品及薄膜的薄厚有關(guān)。選擇時(shí)，先初步定下某一濃度，如電泳槽兩極之間的膜長(zhǎng)度

6、為8 cm10cm，則需電壓25V/cm膜長(zhǎng)，電流強(qiáng)度為0.4mA/cm0.5mA/cm膜寬。當(dāng)電泳達(dá)不到或超過(guò)這個(gè)值時(shí)，則應(yīng)增加緩沖液濃度或進(jìn)行稀釋。緩沖液濃度過(guò)低，則區(qū)帶泳動(dòng)速度快，并由于擴(kuò)散變寬；緩沖液濃度過(guò)高，則區(qū)帶泳動(dòng)速度慢，區(qū)帶分布過(guò)于集中不易分辨。 3、加樣量 加樣品的多少與電泳條件、樣品的性質(zhì)、染色方法與檢測(cè)手段靈敏度密切相關(guān)。作為一般原則，檢測(cè)方法越靈敏，加樣量則越少，對(duì)分離更有利。如加樣量過(guò)大，則電泳后區(qū)帶分離不清楚，甚至互相干擾，染色也較費(fèi)時(shí)。如電泳后用洗脫法定量時(shí)，每厘米加樣線上需加樣品0.1l0.5l約相當(dāng)于5g1000g蛋白。血清蛋白常規(guī)電泳分離時(shí)，每厘米加樣線加樣

7、量不超過(guò)1l，相當(dāng)于60g80g的蛋白質(zhì)。但糖蛋白和脂蛋白電泳時(shí)，加樣量則應(yīng)多些。對(duì)每種樣品加樣量均應(yīng)先作預(yù)實(shí)驗(yàn)加以選擇。 點(diǎn)樣好壞是獲得理想圖譜的重要環(huán)節(jié)之一，以印章法加樣時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕、穩(wěn)，用力不能太重，以免將薄膜弄壞或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。 4、電量的選擇 電泳過(guò)程應(yīng)選擇合適的電流強(qiáng)度，一般電流強(qiáng)度為0.4mA/cm0.5mA/cm寬膜為宜。電流強(qiáng)度高，尤其在溫度較高的環(huán)境中，可引起蛋白質(zhì)變性或由于熱效應(yīng)引起緩沖液中水分蒸發(fā)，使緩沖液濃度增加，造成膜片干涸。電流過(guò)低，則樣品泳動(dòng)速度慢且易擴(kuò)散。 5、染色液的選擇 對(duì)醋酸纖維素薄膜電泳后染色應(yīng)根據(jù)樣品的特點(diǎn)加以選擇。其原則是染料對(duì)被分離樣品有較強(qiáng)的著色力，背景易脫色；應(yīng)盡量采用水溶性染料，不宜選擇醇溶性染料，以免引起醋酸纖維素膜溶解。 應(yīng)控制染色時(shí)間。時(shí)間長(zhǎng)，薄膜底色深不易脫去；時(shí)間短，著色淺不宜區(qū)分，或造成條帶染色不均，必要時(shí)可進(jìn)行復(fù)染。 6、透明及保存 透明液應(yīng)臨用前配制，以免冰乙酸及乙