細胞計數(shù)的標準化

1、對自動化血細胞計數(shù)和白細胞分類后手工檢查標準的建議hzdlj(譯)摘要：自第一臺自動化血球儀問世的半個世紀以來，手工技術(shù)，尤其是顯微鏡下觀察染色血片的技術(shù)，補充了血球儀檢測結(jié)果，使病人的血液標本結(jié)果全面。多年以來，隨著血球儀性能和技術(shù)的不斷改進，自動化血球儀和手工補充手段的角色正在改變，自動化血球儀結(jié)果后的手工操作（重要是手工涂片分析），主要決定于其是否符合一系列復查標準中的一條來。在各個實驗室之間還沒有統(tǒng)一的行為標準。從長遠出發(fā)，需要指定一定普遍能夠接受的規(guī)則，用于血球儀分析后復查細胞計數(shù)和分類。Berend Houwen博士于2002年邀請了20名專家在spring開會，商討規(guī)則細節(jié)，決定

2、最恰當?shù)臉藴?。在這次會議上，一致通過了83條規(guī)則。15個實驗室以13298例血液標本對這些規(guī)進行了測試。并對數(shù)據(jù)進行詳細的分析，這些規(guī)則被重新定義，合并成了本文的41條規(guī)則。包括適用于首次檢查的規(guī)則，同一個病人72小時內(nèi)重新檢查的差值規(guī)則。希望這些規(guī)則對于世界范圍的大多數(shù)血液學實驗室有用。各個實驗室在將本規(guī)則貫徹于病人標本之前，應證實這些規(guī)則的有效性，本文也包含了一些用于驗證的建議條款。關(guān)鍵詞：血細胞，一致，差值，圖象介紹：人類血細胞的分析可以追溯到330年前，列文胡克第一個通過自制的由微小顯微鏡構(gòu)成的簡單的顯微鏡描述了紅細胞，他甚至可以通過顯微鏡測量紅細胞的直徑。復合顯微鏡的發(fā)展使得人們可以

3、對白細胞、紅細胞、血小板進行更為全面的描述，同時檢測技術(shù)的發(fā)展使得可以在規(guī)定的體積內(nèi)對其進行計數(shù)。直到Paul Ehrlich通過用苯胺染料(aniline dyes)對血細胞進行染色，可以區(qū)分細胞核、細胞漿以及一些完好的細胞結(jié)構(gòu)，細胞的世界才變得五顏六色。他把各種不同的白色的細胞（white cells）劃分為五種類型，也就是今天仍然沿用的分類標準。在20世紀前半葉，通過手工操作在固定體積的容器里對白細胞，紅細胞，血小板進行計數(shù)；手工血紅蛋白檢測以及PCV檢測等，在臨床上廣泛應用。這些幾乎都是一成不變地伴隨著顯微鏡對染色的血片進行白細胞分類，以及評估紅細胞和血小板的大小和體積進行評價。195

4、6年，Wallacc Coulter發(fā)明了第一臺自動化血球儀，用于對血細胞進行計數(shù)以及體積描述。這是一個單通道的裝置，克服了手工細胞計數(shù)繁瑣且不精確的缺點。60年代，發(fā)展了多參數(shù)的血細胞計數(shù)分析儀；70年代，兩種技術(shù)在白細胞的分類計數(shù)中相互競爭。其一是圖像分析技術(shù)（image analysis technology），試圖模仿人工顯微鏡檢檢查，由于存在很多局限性，因此并沒有發(fā)展下去；第二種技術(shù)就是應用細胞化學技術(shù)，在自動血球儀上通過“流式（flow）”的方法在不同的計數(shù)池對細胞進行識別，WBC分類也是通過“流式”不同的方法對細胞進行辨別，此項技術(shù)隨后發(fā)展了起來。80年代，血細胞計數(shù)和WBC分類

5、技術(shù)融合進入同一平臺，產(chǎn)生了當前廣泛使用的多參數(shù)“流式”血細胞計數(shù)和分類的血球儀，許多制造商都可以提供。圖象工具也應用運用到這些血球儀以提醒操作者異常細胞形態(tài)的存在以及出現(xiàn)了血球儀不能計數(shù)的異常細胞等，同時還可以提示標本的某些特征，比如血小板聚集，其可以導致不正確結(jié)果的產(chǎn)生。自第一臺自動化血球儀問世以來，手工技術(shù)，特別是顯微鏡對染色血片進行觀察，補充上血球儀的結(jié)果，能為病人血液標本提供了更為廣泛的報告。近年來，由于血球儀的性能和技術(shù)不斷改進，血球儀的角色以及彌補的過程已經(jīng)發(fā)生了改變。我們認識到自動血球儀在WBC、RBC、PLT計數(shù)以及形態(tài)較好的成熟WBC分類中更勝一籌，而顯微鏡檢基于細胞學特征

6、的微小變化，在區(qū)分細胞，尤其是不成熟細胞中更具有優(yōu)勢。對于很多標本，已經(jīng)沒有必要進行顯微鏡檢或者手工分類計數(shù)了。最近，由于控制成本的壓力，以及缺乏訓練有素的工作人員，都逐漸需要在不犧牲結(jié)果質(zhì)量的前提下，減少手工檢查的數(shù)量。因為主要的補充程序是顯微鏡涂片鏡檢，決定每個標本是否有涂片鏡檢的必要性，對于血液學實驗室成本中、工作量、以及出報告的速度都起著重要作用。人工涂片檢查為我們提供額外的或者血球儀漏掉的信息，或者用于驗證血球儀結(jié)果。顯微鏡檢通常是根據(jù)適用于血球儀結(jié)果的涂片鏡檢標準來執(zhí)行的。每個實驗室都制定了自己的血球儀檢測后的工作標準。目的就是減少需要動手（通常是涂片鏡檢）的標本的數(shù)量到最大程度，

7、同時不至于因為錯誤的或者易誤導的報告，尤其是假陰性的結(jié)果而損害病人。盡管如此，單個實驗室?guī)缀鯖]有機會知道自己執(zhí)行的標準對于減少假陽性，假陰性是否是最恰當?shù)?。非正式的信息交換顯示，不同實驗室之間的涂片鏡檢率從5%到95%不等。這是不能完全用病種的不同以及儀器的不同來解釋的。Berend Houwen博士認識到，從長遠來看，需要制定一個普遍能接受的標準，用于血球分析儀分析后復查血細胞計數(shù)以及分類。他邀請了20名專家于2002年在spring商討這個話題，并且在大多數(shù)恰當?shù)臉藴噬线_成了共識。要邀請來的血液學學者代表了6個國家17個實驗室，在復查標準上一流的專家。這些實驗室包括三級醫(yī)院（servici

8、ng tertiary hospitals），腫瘤醫(yī)院，社區(qū)醫(yī)院，兒童醫(yī)院和私立醫(yī)院(doctors office)(見附錄1)。在近三天的時間里，血細胞計數(shù)的每一個參數(shù)都進行了深入的討論，并達成了一致的意見，即在什么情況下復查啟動對自動分析儀分析結(jié)果的復查，大概包含進一步的測試或者涂片復查。來自15個實驗室的代表同意按照隨后會議制定的細則，在他們各自的實驗室對這些規(guī)則進行測試。對規(guī)則驗證以及發(fā)展情況，包括各自對補充臨床血液學實驗室的補充建議，都包含在本文中。材料合方法：為驗證這些規(guī)則的合理性，每個實驗室被要求做1000個標本。這些標本是從一段時間的日常標本里面隨機挑選出來的，代表了實驗室的病

9、種分布。在這1000個標本中，有800個是首檢標本，用于測試關(guān)于首檢標本的規(guī)則。剩下的200個標本是二次檢測標本，用于測試關(guān)于二次檢測標本的規(guī)則。每個實驗室都按照自己的標準操作規(guī)程（SOP）在本室的血球儀上對標本進行檢測。此外，不管SOP文件要求是否對檢測標本進行涂片鏡檢，對所有的標本都進行涂片染色觀察。并在實驗中對所有的病人的標本進行手工涂片分類。如果涂片分類是日常工作中要求的，其結(jié)果也被納入研究。所有的數(shù)據(jù)都上交給指導委員會（steering committee）進行分析。每個成員所提交的數(shù)據(jù)是一張電子表格，包含了每個標本的識別，執(zhí)行的每條規(guī)則情況，涂片鏡檢，儀器圖象（instrument

10、 flag），所有血細胞計數(shù)的結(jié)果，按本實驗室規(guī)則是否需要對標本進行涂片檢查，樣本差值（sample delta），以及每個重要發(fā)現(xiàn)的評價。數(shù)據(jù)由指導委員會成員進行細致的分析和回顧。指導委員會對數(shù)據(jù)進行初步評估后，很明顯：并不是所有的實驗室都使用相同的標準來定義什么是不正常的涂片結(jié)果（陽性發(fā)現(xiàn)）。指導委員會制定了一系列單獨的標準，并將其重新應用于原始數(shù)據(jù)中。表1包含了協(xié)作組依據(jù)臨床相關(guān)性而用來定義涂片陽性（異常發(fā)現(xiàn)）的標準。先對所有實驗室的數(shù)據(jù)進行單獨分析，然后再將所有實驗室數(shù)據(jù)匯總分析。指導委員會對所有的數(shù)據(jù)進行回顧，比較使用各條規(guī)則對外周血進行涂片鏡檢時的觀察結(jié)果。如果符合某條規(guī)則，并且鏡

11、檢也有陽性發(fā)現(xiàn)，那么這個標本就本定義為真陽性；如果符合某條規(guī)則，但是鏡檢并沒有陽性發(fā)現(xiàn)，那么這個標本就本定義為假陽性；如果不符合某條規(guī)則，但是涂片時有陽性發(fā)現(xiàn)，則該標本被定義為假陰性；如果不符合某條規(guī)則，涂片也無陽性發(fā)現(xiàn)，則被定義為真陰性。將正確率表格(truth table)發(fā)放給各個實驗室，然后將來自所有實驗室的數(shù)據(jù)匯總到表2。結(jié)果：因某些實驗室沒有能夠達到1000個標本的要求，故協(xié)作組（consensus group）共提交了13298個病人的分析數(shù)據(jù)。參加協(xié)作的單位的血球儀包括：Abbott CellDyn 4000, Bayer ADVIA 120, Beckman Coulter

12、Gens及LH750, Sysmex se-9000及XE2100。雖然各個實驗室的設備和儀器不同，但是為各個實驗室準備的準確率表格都是相同的，所有樣本總的正確率結(jié)果見表2。最終的關(guān)于關(guān)于自動化血球儀血細胞計數(shù)和分類后復查的規(guī)則4共有1條，見表3。該表列舉了每個參數(shù)復查的標準以及進一步的操作建議。列舉出來的規(guī)則有針對初次檢查的標本，也有針對二次檢查的標本。關(guān)于“差值規(guī)則（delta rules）”一詞的定義見表4。在41條規(guī)則中，15條規(guī)則和血細胞計數(shù)有關(guān)；7條規(guī)則是關(guān)于5種白細胞的分類參數(shù)的；7條是關(guān)于儀器可疑的圖象或者代碼的（包括紅細胞和血小板）；10條是關(guān)于白細胞可疑的圖象或者代碼的，2

13、條是和網(wǎng)織紅細胞有關(guān)的。討論數(shù)據(jù)分析表明：雖然本研究使用了來自不同實驗室的品牌各不相同的血球儀，但是所有的實驗室都有相似的正確率表格。這對于假陰性范圍的統(tǒng)計是十分重要的。指導委員會意識到制定一個良好的復查標準，以在涂片上找到陽性結(jié)果，對于制定正確率表格來說是十分重要的。為了讓這些標準更客觀，更有意義，我們將涂片鏡檢與其臨床意義聯(lián)系起來考慮。顯然，將所有的不異常發(fā)現(xiàn)都標記上是不恰當?shù)模绱笱“?，偶見細胞破裂（occasional schistocyte），輕微的細胞分布不均或者細胞不規(guī)則(slight anisocytosis and poikilocytosis)等可能的異常發(fā)現(xiàn)。我們制定了

14、一系列在我們看來是臨床意義很大的鏡檢發(fā)現(xiàn)（見表一）。使用達成共識的規(guī)則（consensus rules），各個實驗室總的假陰性率只有2.9%（386/13298）。而使用各個實驗室自己的標準，假陰性率也只有3.8%（503/13298）。所以達成共識的規(guī)則的假陰性率和各個實驗室的規(guī)則比起來，似乎沒有多少改進。重要的是我們認識到各個實驗室已經(jīng)在使用共識規(guī)則里的某些條款了。假陰性率的推導和計算見表5。18.6%的假陽性率和各個實驗室的規(guī)則比起來也相似。假陽性率主要是通過各個儀器的圖形判斷的。這可以通過本研究所采用的儀器得出來，這些儀器也代表了目前廣泛應用于血液學實驗室的多參數(shù)的血細胞分析儀。這些儀

15、器作為一個粗篩的設備，通過圖形對異常的標本做進一步的復查。為了避免漏掉一些潛在的重要的異常發(fā)現(xiàn)，減少假陰性率，這些儀器在設計可以圖象的符合標準時都有較高的假陽性率。在數(shù)據(jù)分析完成之后，對這些規(guī)則進行回顧，分析哪些規(guī)則較容易出現(xiàn)以及他們出現(xiàn)的頻率。我們發(fā)現(xiàn)有3條規(guī)則在13298例標本中都沒有出現(xiàn)過。正因如此，很有可能他們在血球儀的日常工作中出現(xiàn)的幾率就不高。此外，聯(lián)系到臨床意義，我們認為不管是在研究中還是在臨床實踐中，其意義不大，所以這些規(guī)則被去掉了。我們通過結(jié)合“相同參數(shù)（like parameter）”個人的理解可能是儀器提示PLT聚集），不論計數(shù)，首先應該檢查標本有無凝塊，其次應該涂片鏡檢

16、估計PLT計數(shù)，如果繼續(xù)聚集，執(zhí)行實驗室SOP。31，血小板直方圖異常（血小板聚集引起的除外），應該涂片鏡檢。32，有不成熟粒細胞（儀器圖像判斷），且為首次檢查時，應該涂片鏡檢。33，有不成熟粒細胞（儀器圖像判斷），34，有核左移的圖像（儀器圖像判斷或者提示），應該執(zhí)行實驗室SOP。35，有異型（變異）淋巴細胞圖像（儀器提示有異淋），且為首次檢查時，應該涂片鏡檢。36，有異型（變異）淋巴細胞圖像（儀器提示有異淋），以前證實過結(jié)果，但是WBC陽性差值失敗，應該涂片鏡檢（希望專家能解釋一下本條規(guī)則-譯者）。37，有原始細胞圖像（儀器提示有原始細胞），且為首次檢查時，應該涂片鏡檢。38，有原始細胞圖像（儀器提