人參總皂苷和小檗堿對肺癌PG細胞分泌免疫抑制性細胞因子的影響

1、人參總皂苷和小檗堿對肺癌PG細胞分泌免疫抑制性細胞因子的影響                            作者：郝鈺, 王萍, 吳?B, 邱全瑛【摘要】  目的：觀察人參總皂苷（ginsenoside, Gs）和小檗堿（berberine, Ber）對腫瘤細胞分泌免疫抑制性細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子1（transf

2、orming growth factor?beta1，TGF?撥?1）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的影響，探討Gs和Ber對腫瘤免疫逃逸的作用機制。方法：首先建立人肺癌PG細胞與人T淋巴細胞株Jurkat細胞的共培養(yǎng)體系，隨機分為Gs（100 g/ml）組、Ber（10 g/ml）組、空白對照組和Jurkat組。用Gs和Ber作用PG細胞24 h后與Jurkat細胞共培養(yǎng)，24 h后倒置顯微鏡下觀察Jurkat細胞生長的狀態(tài)；臺盼藍拒染實驗計數(shù)共培養(yǎng)6 h和24 h后Jurkat活細胞數(shù)；流式細胞儀檢測共培養(yǎng)24 h后Jurkat細胞的凋亡率；100、50、25

3、 g/ml的Gs和10、5、2.5 g/ml的Ber分別處理PG細胞，并設(shè)空白對照組（PG細胞未經(jīng)藥物處理），酶聯(lián)免疫吸附測定法和放射免疫法檢測PG細胞上清液TGF?撥?1和PGE2的含量。結(jié)果：Jurkat細胞與Gs和Ber處理過的PG細胞共培養(yǎng)后，其數(shù)目較空白對照組明顯減少，而凋亡率較空白對照組明顯增加；Gs和Ber可以增加PG細胞TGF?撥?1的分泌，對PGE2的分泌無影響。結(jié)論：Gs和Ber可以增強PG細胞導(dǎo)致的Jurkat細胞生長抑制和凋亡，其機制可能與Gs和Ber增加PG細胞分泌TGF?撥?1有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  人參皂苷類; 小檗堿; 抑制因子, 免疫; 轉(zhuǎn)化生長因子1

4、; 前列腺素E類Objective: To observe the effects of ginsenoside (Gs) and berberine (Ber), two kinds of active components of traditional Chinese herbal medicine, on transforming growth factor?beta1 (TGF?撥?1) and prostaglandin E2 (PGE2) in PG cells.Methods: Co?culture system of human lung carcinoma cell line

5、 PG and human T lymphocyte cell line Jurkat was established. PG cells were treated with Gs (100 g/ml) and Ber (10 g/ml) for twenty?four hours, and then cocultured with Jurkat cells. After 24?hour coculture, the state of Jurkat cells was observed with inverted microscope. The viable count of Jurkat c

6、ells was detected by trypan blue staining after 6? and 24?hour coculture, and the apoptosis of Jurkat cells was evaluated by flow cytometry. PG cells were treated with 100, 50, 25 g/ml Gs and 10, 5, 2.5 g/ml Ber respectively, and the content of TGF?撥?1 and PGE2 in PG cells was detected by enzyme?lin

7、ked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (RIA) method.Results: After coculture with PG cells treated with Gs and Ber, the number of Jurkat cells was less than blank control group, and the apoptosis rates of Jurkat cells in Gs? and Ber?treated groups were higher than blank control group.

8、Gs and Ber could promote the secretion of TGF?撥?1 in PG cells, but could not change the level of PGE2.Conclusion: Gs and Ber can promote the growth inhibition and apoptosis of Jurkat cells induced by PG cells, which may be related to the up?regulation of Gs and Ber on TGF?撥?1 secretion in PG cells.K

9、eywords: ginsenosides; berberine; suppressor factors, immunologic; transforming growth factor 1; prostaglandins E腫瘤的免疫逃逸機制復(fù)雜，可以通過自身分子表達的改變，如腫瘤特異性抗原的缺失、主要組織相容性抗原復(fù)合物（major histocompability complex, MHC）I類分子的缺乏、共刺激分子B7的缺陷、Fas分子下調(diào)耐受凋亡以及“Fas反擊”和分泌免疫抑制性細胞因子等，使腫瘤不能有效地被免疫細胞識別和攻擊，甚至主動下調(diào)宿主免疫功能，從而逃避抗腫瘤免疫反應(yīng)。我們的

10、前期研究結(jié)果表明，Jurkat細胞與PG細胞共培養(yǎng)后數(shù)目減少，人參總皂苷（ginsenoside, Gs）和小檗堿（berberine, Ber）可以促進PG細胞的這種作用，該結(jié)果可能與Gs和Ber增加PG細胞的FasL表達，促進PG細胞誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡的“Fas反擊”作用有關(guān)。但Jurkat細胞與PG細胞共培養(yǎng)后數(shù)目減少的原因除與“Fas反擊”誘導(dǎo)的凋亡有關(guān)外，也有可能與PG細胞分泌某些免疫抑制性細胞因子相關(guān)。本研究檢測了PG細胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子1（transforming growth factor?beta1，TGF?撥?1）和前列腺素E2（prostaglandin E2, P

11、GE2）的情況以及Gs和Ber對此的影響。1  材料與方法1.1  細胞株  人高轉(zhuǎn)移性肺癌細胞PG（本室保存）；人T淋巴細胞株Jurkat（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所）。1.2  藥物與主要試劑  Gs（北京天然藥物研究院趙銳博士惠贈）；Ber（中國藥品生物制品檢定所）；Annexin?V FITC細胞凋亡檢測試劑盒（北京寶賽生物技術(shù)有限公司）；人TGF?撥?1檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；人PGE2放射免疫分析試劑盒（蘇州大學(xué)血液學(xué)研究所）。1.3  藥物劑量與分組  Gs 100 g/ml，Ber 10

12、g/ml。Gs、Ber分別處理PG細胞24 h，PBS緩沖液洗滌3次以洗去藥液，消化離心后調(diào)整細胞濃度至2×105/ml，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，同時設(shè)立未經(jīng)藥物處理的對照組（空白對照組）。待細胞貼壁后（融合至80左右），各組棄去培養(yǎng)液，各加入濃度為3×105/ml的Jurkat細胞懸液10 ml鋪于PG細胞之上進行共培養(yǎng)。實驗共培養(yǎng)組分為3組：Gs組、Ber組和空白對照組，同時設(shè)立Jurkat細胞單獨培養(yǎng)組（Jurkat組）。以上4組每組設(shè)3個樣本。100、50、25 g/ml的Gs和10、5、2.5 g/ml的Ber分別處理PG細胞24 h，棄去藥液，冷PBS洗滌，離

13、心重懸后各組用新鮮培養(yǎng)液調(diào)整至相同濃度，加入96孔培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)24 h（同時設(shè)立不用藥PG細胞組），共7組，每組4個復(fù)孔。1.4  樣本采集  Jurkat細胞與PG細胞共培養(yǎng)6 h和24 h后，小心振蕩培養(yǎng)瓶，使黏附的Jurkat細胞盡量脫落，移出細胞懸液于離心管內(nèi)；各共培養(yǎng)瓶內(nèi)加入胰酶消化液（無乙二胺四乙酸），使黏附的Jurkat細胞進一步脫落，鏡下觀察，至Jurkat細胞基本脫落而PG細胞未脫離時為宜，移入先前移出的Jurkat細胞懸液離心管內(nèi)，離心棄上清，收集細胞，供臺盼藍拒染實驗和凋亡檢測用。收集不同濃度Gs和Ber分別處理過的PG細胞上清液，供TGF?撥?1和

14、PGE2檢測用。1.5  Jurkat細胞的生長狀態(tài)觀察  共培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察各組Jurkat細胞的生長情況。1.6  臺盼藍拒染實驗檢測Jurkat活細胞數(shù)  將共培養(yǎng)6 h和24 h后收集的Jurkat細胞調(diào)整至相同體積，臺盼藍拒染實驗觀察Jurkat活細胞數(shù)。1.7  流式細胞儀檢測Jurkat細胞的凋亡  按試劑盒說明書步驟進行。1.8  酶聯(lián)免疫吸附測定法和放射免疫法分別檢測TGF?撥?1和PGE2含量  依據(jù)檢測試劑盒的說明書進行檢測。1.9  甲基噻唑基四唑法檢測Gs和Ber

15、對PG細胞增殖的后遺效應(yīng)  采集上清液后，運用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法檢測PG細胞的增殖情況，以判斷去除藥物作用24 h后PG細胞數(shù)目的差異。1.10  統(tǒng)計學(xué)方法  用SPSS 11.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，計量資料用x±s表示，采用單因素方差分析并進行組間兩兩比較。2  結(jié)果2.1  Gs、Ber處理的PG細胞對Jurkat細胞生長狀態(tài)的影響  倒置顯微鏡下可以觀察到，培養(yǎng)24 h后，Jurkat細胞在單獨培養(yǎng)的情況下，呈現(xiàn)成團生長現(xiàn)象，伴有散在細胞的生長，

16、而共培養(yǎng)組Jurkat細胞均呈散在生長狀態(tài)；共培養(yǎng)Gs組和Ber組Jurkat細胞的數(shù)目均較空白對照組少。見圖1。圖1  Jurkat 細胞與Gs、Ber處理的PG細胞共培養(yǎng)24 h的生長狀態(tài)（倒置顯微鏡，×100）（略）Figure 1  Growth status of Jurkat cells cocultured with PG cells treated with Gs and Ber for 24 h (Inverted microscope, ×100)A: Jurkat cells group (uncocultured control)

17、; B: Blank control group (cocultured with untreated PG cells); C: Gs?treated group (cocultured with Gs?treated PG cells); D: Ber?treated group (cocultured with Ber?treated PG cells).2.2  GS、Ber處理的PG細胞對Jurkat活細胞數(shù)目的影響  臺盼藍拒染實驗結(jié)果顯示，Jurkat細胞與未經(jīng)藥物處理的PG細胞共培養(yǎng)6 h和24 h后，Jurkat細胞生長受到抑制，活細胞數(shù)目明顯減少，與Ju

18、rkat組活細胞數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；Gs組的Jurkat細胞在共培養(yǎng)6 h和24 h后，Jurkat細胞受到抑制的程度均較空白對照組明顯，Ber組Jurkat細胞在共培養(yǎng)24 h后其抑制程度與空白對照組比較，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表1。百事通2.3  流式細胞儀檢測共培養(yǎng)體系中Jurkat細胞的凋亡  流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，Jurkat細胞在單獨培養(yǎng)條件下的自然凋亡率較低，而各共培養(yǎng)組均表現(xiàn)出較高的凋亡率，兩者不論在早期還是中晚期，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；共培養(yǎng)組中，Gs組Jurkat細胞早期凋亡率與空

19、白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.029），Ber組Jurkat細胞早期凋亡率與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Gs組和Ber組Jurkat細胞的中晚期凋亡率與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但Gs組與Ber組Jurkat細胞的總凋亡率與空白對照組比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001，P=0.030）。見表2。表1  與PG共培養(yǎng)后的Jurkat活細胞數(shù)（略）Table 1  Viable cell count of Jurkat cells after coculture with PG cells*P<0.01, vs blank control gr

20、oup; P<0.05, P<0.01, vs Jurkat cells group.表2  流式細胞儀檢測Jurkat細胞的凋亡率（略）Table 2  Apoptosis rate of Jurkat cells detected by flow cytometry*P<0.05, *P<0.01, vs blank control group; P<0.01, vs Jurkat cells group.2.4  酶聯(lián)免疫吸附測定法和放射免疫法分別檢測TGF?撥?1和PGE2的分泌  結(jié)果顯示，PG細胞培養(yǎng)上清液中有T

21、GF?撥?1和PGE2的存在，100 g/ml Gs可以上調(diào)TGF?撥?1水平，5、2.5 g/ml Ber也可以上調(diào)TGF?撥?1水平；但各濃度Gs和Ber均對PGE2的分泌無影響。見表3。表3  PG細胞培養(yǎng)上清液中TGF?撥?1和PGE2的含量（略）Table 3  Content of TGF?撥?1 and PGE2 in PG cell culture supernatants*P<0.05, vs blank control group.2.5  Gs和Ber培養(yǎng)后PG細胞的增殖情況及與TGF?撥?1分泌的關(guān)系  100 g/ml G

22、s可抑制肺癌PG細胞的增殖，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明低劑量Gs對PG細胞的增殖無影響；Ber能抑制PG細胞的增殖，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并呈劑量依賴性。盡管高劑量Gs組（100 g/ml）和中、低劑量Ber組（5 g/ml、2.5 g/ml）的細胞數(shù)量較空白對照組少（MTT值反映），但其分泌的TGF?撥?1濃度比空白對照組高；因此可以認為高劑量Gs組和中、低劑量Ber組TGF?撥?1分泌的增加并不是由于細胞數(shù)量的增加所致。見圖2和圖3。圖 2  PG細胞TGF?撥?1分泌量（略）Figure 2  Concentration of TGF?撥?

23、1 in PG cells圖 3  MTT法檢測PG細胞數(shù)目（略）Figure 3  PG cell number detected by MTT method3  討論    研究表明，腫瘤細胞能分泌免疫抑制性細胞因子，如TGF?撥?1、IL?4、IL?6、IL?10、PGE2、血管內(nèi)皮生長因子和一氧化氮等，抑制免疫細胞的增殖和分化，促進Th1?Th2平衡向Th2漂移，并下調(diào)T細胞黏附或協(xié)同刺激分子的表達，誘導(dǎo)對腫瘤免疫特異性細胞毒T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）的耐受等1。  

24、;  TGF?撥?1被認為是一種早期抑癌因子，隨著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其表達及激活的變化、其受體或受體后水平信號Smads的缺陷以及癌基因突變等異常情況，均可使腫瘤細胞失去對TGF?撥?1的敏感性，導(dǎo)致其生長抑制作用減弱或消失2。有研究表明，許多腫瘤細胞能分泌TGF?撥?13，并與患者的預(yù)后呈負相關(guān)。TGF?撥?1能影響宿主免疫細胞的增殖分化，誘導(dǎo)凋亡。Mouri等4研究表明，肝癌細胞能產(chǎn)生TGF?撥?1，抑制CTL和自然殺傷細胞的增殖和活化，從而增強腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視的能力。本研究結(jié)果表明，Gs和Ber均能增加PG細胞TGF?撥?1的分泌，這可能是Gs和Ber促進PG細胞導(dǎo)致的Ju

25、rkat細胞生長抑制的機制之一。但Gs和Ber促進PG細胞TGF?撥?1分泌的利弊還有待于深入研究，原因在于TGF?撥?1作用的復(fù)雜性，很難根據(jù)單一作用判斷它的整體效應(yīng)。Ashley等5研究表明，TGF?撥?1的增加盡管抑制了CTL的抗腫瘤免疫反應(yīng)，但TGF?撥?1的整體影響則會抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤SMA560在小鼠體內(nèi)的生長。    PGE2主要是由巨噬細胞合成和釋放，是一種免疫調(diào)節(jié)劑，在機體處于應(yīng)急狀態(tài)下，通過對T細胞以及一些炎性介質(zhì)、趨化因子的抑制作用，對機體產(chǎn)生保護作用。在嚴重?zé)齻?、?chuàng)傷、敗血癥等情況時明顯增高，PGE2的強免疫抑制活性可抑制淋巴細胞的增殖反應(yīng)、

26、中性粒細胞吞噬功能以及巨噬細胞的抗原呈遞能力，且可以激活抑制性T細胞6。有臨床研究表明，一些消化道腫瘤可以通過合成和釋放高水平的PGE2，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而逃脫免疫攻擊7。近來的研究也顯示，其他腫瘤也可以分泌PGE28。本研究體外培養(yǎng)肺癌PG細胞，通過放射免疫法檢測發(fā)現(xiàn)，PG細胞培養(yǎng)上清液中有PGE2分泌，但Gs和Ber對PGE2的分泌無明顯影響。    Gs和Ber的作用復(fù)雜，具有有利于抗腫瘤的一面，也有不利的一面。如Tatsuka等9研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh2在抑制惡性轉(zhuǎn)化細胞增殖的同時，也可以促進其侵襲轉(zhuǎn)移能力。本研究組前期研究10，11也發(fā)現(xiàn)，Ber能

27、抑制腫瘤增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的許多環(huán)節(jié)，也能抑制淋巴細胞的再循環(huán)和增殖，從而抑制免疫反應(yīng)。提示在運用藥物時，應(yīng)當(dāng)權(quán)衡利弊，合理應(yīng)用。【參考文獻】  1 Frumento G, Piazza T, Di Carlo E, et al. Targeting tumor?related immunosuppression for cancer immunotherapy. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 2006; 6(3): 233?237.2 Fukuchi M, Nakajima M, Miyazaki T, et al. Lack of

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