納洛酮對(duì)大鼠腦復(fù)蘇后細(xì)胞凋亡基因調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

1、納洛酮對(duì)大鼠腦復(fù)蘇后細(xì)胞凋亡基因調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究                 【摘要】 目的 觀察鹽酸納洛酮對(duì)大鼠腦復(fù)蘇后海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡及其相關(guān)調(diào)控基因蛋白表達(dá)的影響，探討鹽酸納洛酮腦保護(hù)的分子生物學(xué)機(jī)制。方法 將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、單純腦缺血再灌注組和腦復(fù)蘇鹽酸納洛酮治療組，制作大鼠腦缺血再灌注模型，分別用TUNEL和免疫組化法檢測(cè)各組動(dòng)物腦復(fù)蘇后海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡率和Bcl-2、Bax、p53、Fas的蛋白表達(dá)。結(jié)果

2、 治療組大鼠腦組織中凋亡細(xì)胞數(shù)低于缺血再灌注組，Bcl-2的表達(dá)明顯高于缺血再灌注組，Bax、p53、Fas的表達(dá)低于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論 納洛酮可能通過(guò)促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)和抑制Bax、p53、Fas的表達(dá)來(lái)減少腦復(fù)蘇后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮其腦保護(hù)的作用。 【關(guān)鍵詞】 腦復(fù)蘇；納洛酮；凋亡；基因Experimental study of naloxone on rat cellular apoptosis and the mechanism of genic regulation after brain resuscitationAbstract Objective To ob

3、serve the effects of naloxone on rat cellular apoptosis and the expression of the relevant regulatoty genes after brain resuscitation and to explore the molecular mechanism of naloxone on neuro protection.Methods The rats were pided into three groups:the dummy operative group，the simple ischemia-rep

4、erfusion.To detect the cellular apoptosis and the protein expression of Bcl-2，Bax，p53 and Fas.Results The number of cell apoptosis in the treatment group was lower than that in ischemia-reperfusion group，and the expression of Bcl-2 was significantly higher than that in ischemia-reperfusion group.And

5、 the expressions of Bax，p53 and Fas in the treatment group were lower than those in the contrast group.Conclusion Naloxone can play an role in the protection of brain through diminishing neurocyte apoptosis by promoting the expression of Bcl-2 and restraining the expression 歡迎您訪問(wèn)納洛酮對(duì)大鼠腦復(fù)蘇后細(xì)胞凋亡基因調(diào)控機(jī)制

6、的實(shí)驗(yàn)研究 of Bax，p53 and Fas.Key words brain resuscition;naloxone;apoptosis gene大量臨床研究已證實(shí)納洛酮的腦保護(hù)作用，但其腦保護(hù)的機(jī)制目前尚未完全闡明。近年研究已顯示，腦復(fù)蘇后存在細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因的表達(dá)改變。有關(guān)納洛酮對(duì)腦復(fù)蘇后細(xì)胞凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)影響的研究，國(guó)內(nèi)、外報(bào)道不多。本實(shí)驗(yàn)采用TUNEL法及免疫組化法，分別觀察納洛酮對(duì)大鼠腦復(fù)蘇后海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡及調(diào)控凋亡的相關(guān)基因Bcl-2、Bax、p53、Fas蛋白表達(dá)的影響，從分子生物學(xué)角度進(jìn)一步探討納洛酮的腦保護(hù)作用。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康

7、Wistar大鼠120只雌雄不拘，體重（250±50）g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，將大鼠隨機(jī)分成3組：假傷對(duì)照組（40只）、缺血10 min再灌注24 h組（40只） 及治療組（40只），3組再分為凋亡細(xì)胞組、Bcl-2組、Bax組、p53組、Fas組，每一亞組各8只。1.2 腦缺血再灌注模型 腦缺血再灌注模型1方法建立大鼠急性全腦缺血再灌注模型。以6%水合氯醛0.5 ml/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉，在大鼠頸部背側(cè)切開(kāi)皮膚，暴露第一頸椎兩側(cè)翼小孔，電凝兩側(cè)椎動(dòng)脈，局部縫合；24 h后，動(dòng)物以乙醚麻醉后，作頸前切口，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，待動(dòng)物清醒后，以微動(dòng)脈夾夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)

8、脈，用腦電圖檢測(cè)腦電波，出現(xiàn)靜息腦電波為全腦缺血，否則棄之。10 min后松開(kāi)動(dòng)脈夾，再灌注24 h，縫合皮膚切口。假手術(shù)組只分離第一頸椎兩側(cè)翼小孔，但不電凝兩側(cè)椎動(dòng)脈，只分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，但不夾閉之。實(shí)驗(yàn)中保持大鼠體溫（37±0.5），未昏迷或缺血后有癲癇、抽搐等并發(fā)癥大鼠均放棄。治療組于夾閉前10 min腹腔注射鹽酸納洛酮5 mg/kg（北京四環(huán)制藥廠生產(chǎn)），后每隔4 h等量注射一次。假手術(shù)組和對(duì)照組于相同的時(shí)間點(diǎn)分別予等量的生理鹽水。1.3 標(biāo)本采取和組織切片制備 所有Wistar大鼠腦缺血10 min再灌注后24 h，用40 g/L多聚甲醛經(jīng)心臟灌注后斷頭取腦，于前囟以美藍(lán)標(biāo)

9、記，冠狀切取由前向后25 mm組織塊，固定、脫水、透明石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚4 m。1.4 指標(biāo)檢測(cè) 采用TUNEL法原位標(biāo)記DNA片段檢測(cè)凋亡細(xì)胞。采用SP法進(jìn)行Bcl-2、Bax、p53、Fas的免疫組織化學(xué)染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察TUNEL及Bcl-2、Bax、p53、Fas的免疫反應(yīng)結(jié)果，并計(jì)數(shù)，計(jì)算平均陽(yáng)性率。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均以SPSS 10.0 for統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，采用的統(tǒng)計(jì)方法為2檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 腦復(fù)蘇后海馬CA1區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù) 如表1所示，對(duì)照組、治療組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較假手術(shù)組明顯增加，二者與假手術(shù)組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

10、P<0.05）；同時(shí)，治療組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少，兩組之間亦存在顯著差異（P<0.05）。2.2 Bcl-2蛋白在各組的陽(yáng)性率表達(dá) 與假手術(shù)組比較，Bcl-2蛋白在對(duì)照組、治療組大鼠中均有明顯的陽(yáng)性表達(dá)，二者與假手術(shù)組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但在治療組較對(duì)照組明顯增多，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。2.3 Bax蛋白在各組的陽(yáng)性率表達(dá) Bax蛋白在對(duì)照組大鼠中有明顯的陽(yáng)性表達(dá)，分別與假手術(shù)組、治療組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；雖其陽(yáng)性表達(dá)在治療組較假手術(shù)組為低，但兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。2.4

11、 p53蛋白在各組的陽(yáng)性率表達(dá) 與假手術(shù)組比較，p53蛋白在對(duì)照組、治療組大鼠中均有明顯的陽(yáng)性表達(dá)，二者與假手術(shù)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但在對(duì)照組較治療組明顯增多，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。2.5 Fas蛋白在各組的陽(yáng)性率表達(dá) 與假手術(shù)組比較，F(xiàn)as蛋白在對(duì)照組、治療組大鼠中均有明顯的陽(yáng)性表達(dá)，二者與假手術(shù)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但在對(duì)照組較治療組明顯增多，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。表1 腦復(fù)蘇后細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白陽(yáng)性率表達(dá)注：治療組與對(duì)照組比較，*P<0.05；兩組分別與假手術(shù)組比

12、較，P<0.053 討論研究證實(shí)，心肺腦復(fù)蘇后細(xì)胞凋亡參與了繼發(fā)性腦損害2。細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的主動(dòng)細(xì)胞死亡，許多基因如Bcl-2、C-myc、C-fos、Caspase 3、p53、Fas、Bax 等均參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生。野生型p53主要通過(guò)誘導(dǎo)WAF1/CIP1基因的表達(dá)致細(xì)胞凋亡，又可通過(guò)下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax，及增強(qiáng)CD95基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。作為腫瘤壞死因子受體和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體家庭成員之一的Fas具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2的過(guò)表達(dá)可抑制其致細(xì)胞凋亡的作用。鹽酸納洛酮作為阿片受體競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，近年已被廣泛應(yīng)用于臨床心肺腦復(fù)蘇等急危病的搶救3。實(shí)驗(yàn)已證明阿片肽參

13、與腦缺血損傷的病理生理過(guò)程，納洛酮可通過(guò)拮抗阿片肽的病理生理效應(yīng)而起到腦保護(hù)作用4。內(nèi)源性阿片肽刺激興奮性氨基酸的大量釋放，導(dǎo)致受體門(mén)控的Ca2+細(xì)胞內(nèi)流，而已有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)納洛酮可通過(guò)拮抗內(nèi)源性阿片肽活性，減少全腦缺血再灌注后腦組織總鈣水平，從而減少鈣內(nèi)流即抑制鈣超載5，而B(niǎo)cl-2抗細(xì)胞凋亡機(jī)制之一為抑制Ca2+釋放。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，治療組大鼠腹腔注射納洛酮，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。表明納洛酮可減少心肺腦復(fù)蘇后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，具有腦保護(hù)的作用。同時(shí)，在本實(shí)驗(yàn)的研究中，治療組大鼠Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P0.05），p53、

14、Fas陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)則明顯低于對(duì)照組（P0.05），雖然Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)在手術(shù)組和治療組之間無(wú)差異，但數(shù)量在治療組是減少的，提示納洛酮的腦保護(hù)作用與下調(diào)p53、Fas、Bax蛋白的表達(dá)和上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，阿片的過(guò)度激活可明顯上調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，而抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)凋亡的作用6，7。納洛酮作為阿片受體競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，可能通過(guò)抑制阿片類(lèi)物質(zhì)的促凋亡作用，以達(dá)到減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，這其中可能就通過(guò)下調(diào)p53、Fas、Bax蛋白的表達(dá)和上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，重新調(diào)整了調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)的平衡而起到了腦保護(hù)作用。綜上所述，腦復(fù)蘇后細(xì)胞凋亡調(diào)控基因表達(dá)失調(diào)，誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重腦損傷程度；納洛酮干預(yù)后，可改變腦復(fù)蘇后