蝮蛇抗栓酶對(duì)骨骼肌缺血再灌注損傷保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究

1、    蝮蛇抗栓酶對(duì)骨骼肌缺血 再灌注損傷保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究          摘要為探討骨骼肌缺血再灌注損傷前后微循環(huán)變化及蝮蛇抗檢酶(Svate)的保護(hù)作用，將24只兔隨機(jī)分成兩組，以氣囊止血帶造成兔左下肢缺血再灌注損傷模型。實(shí)驗(yàn)組分別在缺血前及再灌注前給予Svate靜注，對(duì)照組給予等量生理鹽水，以微循環(huán)顯微鏡觀察兔缺血前及再灌注后骨骼肌微循環(huán)的變化。結(jié)果顯示，Svate通過疏通微循環(huán)對(duì)骨骼 肌缺血再灌注損傷起保護(hù)作用。關(guān)鍵詞缺血再灌注損傷微循環(huán)蝮蛇抗栓酶

2、中分類號(hào)：R 331.3+5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1004-4337(2000)03-0259-02在骨科臨床工作中，常可遇到骨骼肌缺血再灌注(I/R)損傷的問題。本實(shí)驗(yàn)通過微循環(huán)顯微鏡直接觀測骨骼肌I/R前后微循環(huán)狀況的變化及運(yùn)用蝮蛇抗栓酶(Svate)保護(hù)后骨骼肌微循環(huán)的變化，探討骨骼肌I/R損傷的機(jī)制，并為臨床防治該損傷提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組新西蘭大耳白兔24只，體重1.82.4kg，隨機(jī)分為兩組，A組為對(duì)照組，B組為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組于上止血帶前10min和松止血帶前10min分鐘靜注Svate 0.0125U/kg(沈陽第一制藥廠)，對(duì)照組注射等容量生理鹽水。1

3、.2實(shí)驗(yàn)方法3%戊巴比妥鈉(1ml/kg)耳緣靜脈注射麻醉，無菌條件下解剖出左趾長伸肌腱肌肉肌腱移行部至斜韌帶之間的部分，保證腱系膜完整，用微循環(huán)顯微鏡(WX-753B 型，徐州光學(xué)儀器廠生產(chǎn))觀察肌腱系膜微循環(huán)狀況并錄相，以微循環(huán)機(jī)像 測量系統(tǒng)(XTW型，北京光電技術(shù)公司生產(chǎn))進(jìn)行微循環(huán)測定分析。觀察10min后，在兔左大腿中上段上氣囊止血管，驅(qū)血后充氣至4.0KPa。缺血4h后松開止血帶并再次觀察肌腱表面微循環(huán)狀況至再灌注后2h。1.3檢驗(yàn)項(xiàng)目微循環(huán)指標(biāo)三級(jí)微血管血流速度測定根據(jù)微循環(huán)顯微鏡下微血管分布特點(diǎn)：1級(jí)為細(xì)動(dòng)脈，2級(jí)為后微動(dòng)脈，3級(jí)為真毛細(xì)血管；白細(xì)胞附壁；白色微栓；紅細(xì)胞聚集；

4、無復(fù)流現(xiàn)象(no-reflow phenomenon)：將微循環(huán)各指標(biāo)分正常、輕、中、重四度1,2。組織病理學(xué)檢查電鏡。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)描述，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)(t檢驗(yàn)和q檢驗(yàn))。2結(jié)果2.1微循環(huán)變化。表1兔左后肢I(xiàn)/R前后微循環(huán)變化(n=24)檢測指標(biāo)A組B組T0T1T2T0T1T2白細(xì)胞聚集±+±±+白細(xì)胞附壁-+-±+白色微栓-+-+滲出-+-+滲血-+-無復(fù)流±±+注：(-)無；(+)輕度；()中度；()重度 2.1.1缺血前(T0)兩組微血管血流快，血細(xì)胞聚集不明

5、顯，偶見白色微栓和少量白細(xì)胞附壁，極少有無復(fù)流(no-reflow)現(xiàn)象，未見滲出及滲血。2.1.2缺血4h，再灌注后10min(T1)A組：微血管血流減慢，紅細(xì)胞中度聚集，有較多白細(xì)胞附壁及少量白色微栓，部分微血管出現(xiàn)無復(fù)流，輕度滲出，無滲血。B組：紅細(xì)胞聚集不明顯，僅真毛細(xì)血管血流減緩，但仍明顯快于A組，白細(xì)胞附壁、白色微栓及無復(fù)流現(xiàn)象較少，無明顯滲出和滲血。2.1.3缺血4h再灌注2h(T2)A組：紅細(xì)胞重度聚集，血流進(jìn)一步減慢，有中度白細(xì)胞附壁和較多的白色微栓，無復(fù)流現(xiàn)象加重，少數(shù)細(xì)靜脈、毛細(xì)血管滲血。B組：血流亦減慢，但各級(jí)血管流速明顯快于A組，紅細(xì)胞輕度聚集，白細(xì)胞附壁及白色微栓量

6、少于A組，無復(fù)流現(xiàn)象較輕，有輕度滲出，無滲血。2.2電鏡A組：線粒體極度腫脹，結(jié)構(gòu)不清，甚至崩解，嵴減少甚至消失，多處肌絲溶解，糖原消失，有散在局限性壞死灶，少量肌細(xì)胞核濃縮邊集。B組：線粒體腫脹，嵴減少，無壞死灶及肌絲溶解，糖原減少，少量肌絲斷裂，肌細(xì)胞核無異常。表2兔左后肢I(xiàn)/R后各級(jí)微血管血流速度變化(n=24,mm/s,±s)血管分級(jí)A組B組T0T1T2T0T1T21級(jí)0.515±0.0230.370±0.023*0.311±0.014*0.505±0.0250.526±0.0300.509±0.0382級(jí)A0.40

7、4±0.0200.291±0.021*0.250±0.027*0.393±0.0230.398±0.0440.321±0.033*V0.270±0.0170.221±0.017*0.201±0.015*0.268±0.0200.255±0.0210.239±0.0173級(jí)0.279±0.0220.212±0.020*0.139±0.020*0.297±0.0210.257±0.019*0.230±0.028*注：自身

8、對(duì)照：*與T0相比，P<0.01,*與T1相比，P<0.01；組間對(duì)照：BT2與AT2相比，P<0.01 3討論缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury)是臨床中常見的一種復(fù)雜病理生理變化，可導(dǎo)致局部甚至遠(yuǎn)處組織或器官的損傷，其損傷機(jī)制目前研究較多的是氧自由基學(xué)說、脂質(zhì)過氧化學(xué)說、白細(xì)胞損傷學(xué)說以及最近提出的細(xì)胞凋亡學(xué)說等等，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)微循環(huán)損傷學(xué)說也是缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。再灌注損傷可造成紅細(xì)胞膜膜磷脂分子過氧化損傷，從而引起紅細(xì)胞膜流動(dòng)性乃至整個(gè)細(xì)胞變形性的明顯惡化3。同時(shí)，再灌注損傷可引起纖維蛋白原(Fib)增高，F(xiàn)ib能吸附于紅細(xì)胞表

9、面，使紅細(xì)胞間的靜電斥力降低，紅細(xì)胞聚集性增加4。微循環(huán)血流緩慢，切變率降低，亦可促使紅細(xì)胞聚集。本實(shí)驗(yàn)觀察到大量白細(xì)胞附壁，有學(xué)者認(rèn)為缺血再灌注損傷是由白細(xì)胞聚集、粘附于血管內(nèi)皮而引發(fā)的5。再灌注后產(chǎn)生的白細(xì)胞粘附分子Mac-1可促進(jìn)白細(xì)胞粘附于骨骼肌微循環(huán)的內(nèi)皮，減少肌肉血流量并釋放氧自由基和蛋白水解酶致組織損傷6。白細(xì)胞粘附于血管壁可釋放血栓素A2(TxA2)7，TxA2是一種血小板趨化劑，可促進(jìn)血小板聚集，聚集的血小板可釋放ADP、TxA2等又引起更多的血小板聚集，最終激活凝血酶，導(dǎo)致白色微檢形成。再灌注損傷可引起無復(fù)流(no-reflow)現(xiàn)象，肌肉組織在缺血13h后很容易灌注再通，

10、而缺血5h后只有4050%可以灌注再通。無復(fù)流現(xiàn)象多由機(jī)械性阻塞所致，與以下因素有關(guān)：白細(xì)胞附壁；血小板聚集、白色微栓形成；紅細(xì)胞聚集、紅細(xì)胞變形能力下降；毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫脹；血液粘度增高及流速減慢，再灌注后以上因素逐漸加重，導(dǎo)致no-reflow現(xiàn)象加重。本實(shí)驗(yàn)中I/R損傷所致的紅細(xì)胞聚集、白細(xì)胞附壁、白色微栓的形成均可使血液粘度增高、血液流速減慢，而血粘度增高、流速減慢又可進(jìn)一步促進(jìn)紅細(xì)胞聚集、白色微栓形成，這種惡性循環(huán)可解釋再灌注后隨時(shí)間的推移，微循環(huán)障礙逐漸加重。另外，聚集的紅細(xì)胞攜氧能力下降，加之血流緩慢、無復(fù)流現(xiàn)象加重，使骨骼肌仍處于一種缺血缺氧狀態(tài)。Svate中含有類凝血酶，

11、它可切除血漿Fib中的纖維蛋白肽A，但不激活凝血因子X，所以其水解產(chǎn)生的纖維蛋白凝塊的側(cè)鏈不能交鏈，易被纖維蛋白酶降解，導(dǎo)致體內(nèi)Fib濃度降低而表現(xiàn)出抗凝效應(yīng)8。Svate通過降低Fib，增強(qiáng)紅細(xì)胞間的靜電斥力，降低其聚集力，使紅細(xì)胞解聚、血液粘度下降，從而改善血液流動(dòng)性，加快血液流動(dòng)。Svate中含有A型磷酯酶A2(A-PLA2)，是血小板聚集抑制劑，可使血漿中PGI2含量增加、TxA2濃度降低，從而預(yù)防白色微栓的形成。紅細(xì)胞變形是微循環(huán)保持有效灌注的必要條件，Svate可增加紅細(xì)胞的變形能力，使紅細(xì)胞與組織間物質(zhì)與氣體的交換面積增大，從而增加組織供氧。白細(xì)胞附壁與再灌注損傷關(guān)系密切，Cri

12、nnion應(yīng)用抗Mac-1抑制白細(xì)胞附壁，可減輕肌肉壞死，改善肌肉微循環(huán)灌注6。本實(shí)驗(yàn)觀察到Svate可使再灌注后白細(xì)胞附壁量明顯下降，Svate抑制白細(xì)胞附壁的機(jī)制可能與增加血液流速、減輕紅細(xì)胞聚集、降低血液粘度及血管內(nèi)皮損傷有關(guān)?？傊琒vate通過降低血液粘度、加快血液流速、防止紅細(xì)胞聚集、增強(qiáng)紅細(xì)胞變形能力、抑制白細(xì)胞附壁抑制血小板聚集、預(yù)防白色微栓形成、減少no-reflow發(fā)生，從而改善骨骼肌微循環(huán)狀況，對(duì)骨骼肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。唐新宇（深圳市中心醫(yī)院深圳518036）范里（深圳市中心醫(yī)院深圳518036）劉世清（深圳市中心醫(yī)院深圳518036）李家元（深圳市中心醫(yī)院深圳

13、518036）參考文獻(xiàn)1，李向紅.常用微循環(huán)基本名詞和容易混淆的概念.臨床微循環(huán)檢查手冊(cè).第一版.中國醫(yī)藥科技出版社，1992，165.2，范里，劉世清.骨骼肌缺血再灌注損傷后血液流變性及微循環(huán)變化.微循環(huán)學(xué)雜志，1999，9(1)：1315.3，Huang YM, Zhao H, Yu X, et al. Damaging mechanism of free radical to the membrane molecules of red blood cell. Acta Biophys Sin. 1997,13(2):315323.4，滿昌軍，董香玉，朱傳安.高血脂和高纖維蛋白原對(duì)紅細(xì)胞電

14、泳時(shí)間的影響.微循環(huán)學(xué)雜志，1998，8(1)：48.5，Dahouk S, Plappert U, Gerngross H, et al. Systemic genotoxic effect caused by ischemia reperfusion. Surgical trauma of the lower extremity-detection of DNA chain breaks in leukocytes with the comet assay. Langenbecks Arch Chir Suppl Kongressbd. 1997,114:601254.6，Crinnion JN, Homer-Vanniasinkam S, Parkin SM, et al. Role of neutrophil-endothelial adhesion in skeletal muscle reperfusion injury. Br J Surg. 1996,83(2):251254.7，Crinnion JN, Homer-Vanniasinkam S, Parkin SM, et al. Neutrophils and the endotheli