細(xì)胞周期分析重要知識(shí)(源自MultiCycle)

1、細(xì)胞周期生物學(xué)基礎(chǔ)細(xì)胞的生成依賴于細(xì)胞的分裂而產(chǎn)生兩個(gè)子代細(xì)胞的過程。在分裂過程最需要復(fù)制并傳遞給子代細(xì)胞的是細(xì)胞核，因?yàn)樗思?xì)胞的遺傳信息載體-DNA。在絕大多數(shù)情況下，一個(gè)生物體的每個(gè)細(xì)胞都含有相等的DNA物質(zhì)和相同成份的染色體。因此，細(xì)胞在分裂前必須復(fù)制DNA這樣它的子代細(xì)胞就能夠擁有與父代相同的DNA含量。細(xì)胞由DNA含量增加至分裂，再由它的子代繼續(xù)復(fù)制并分裂，這個(gè)過程稱之為細(xì)胞周期。在細(xì)胞周期中最具特征性的階段是在分裂前的DNA含量增加并達(dá)到2倍量的時(shí)候，并在此時(shí)細(xì)胞開始分裂其自身-有絲分裂期。細(xì)胞周期中這兩個(gè)循環(huán)步驟通常以一字母來表示：S期（合成期）和M期（有絲分裂期）。當(dāng)細(xì)胞

2、周期中的S期和M期被定義后，我們可觀察到在有絲分裂完成后和DNA合成剛開始之時(shí)有短暫的停頓或間隙，同樣的停頓或間隙存在于DNA合成期后和有絲分裂開始之時(shí)。這兩個(gè)間隙我們將之命名為G1和G2期。這樣整個(gè)細(xì)胞周期可劃分為G1 S G2 M G1，如下圖所示：圖1顯示了細(xì)胞周期中個(gè)環(huán)節(jié)在流式細(xì)胞儀上分析時(shí)的圖譜特征當(dāng)細(xì)胞沒有進(jìn)入分裂過程時(shí)（我們機(jī)體中的絕大部分細(xì)胞），它們處于細(xì)胞周期的G1期的位置上。因此G1細(xì)胞在數(shù)量上絕對是居各期細(xì)胞之首并在流式圖譜上形成最高的信號(hào)峰。在G1期細(xì)胞中有一群細(xì)胞特別安靜并且沒有進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)的任何生物學(xué)特征，我們稱這些細(xì)胞為G0期細(xì)胞。一些發(fā)生在G1和G2期細(xì)胞內(nèi)的生

3、物過程現(xiàn)還不完全明了。處于G1期的細(xì)胞已開始為分裂前的DNA的復(fù)制和細(xì)胞成長準(zhǔn)備許多RNA和蛋白分子。處于G2期的細(xì)胞則會(huì)修復(fù)在DNA復(fù)制過程發(fā)生的錯(cuò)誤并識(shí)別出在M期時(shí)將DNA平均等分的切割位置。細(xì)胞循環(huán)中這些階段的長度因細(xì)胞種類的不同而不同。典型細(xì)胞循環(huán)中各期的發(fā)展時(shí)間為：G1期12小時(shí)，S期6小時(shí)，G2期4小時(shí)及M期0.5小時(shí)。分析和流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分析 流式細(xì)胞最初的應(yīng)用之一便是檢測細(xì)胞的DNA含量，它可快速將細(xì)胞循環(huán)中的其它階段與有絲分裂期區(qū)別開來。這些檢測是基于對細(xì)胞內(nèi)DNA以化學(xué)定量方式的染色（染料著色數(shù)量直接與細(xì)胞內(nèi)DNA含量相關(guān)）。有相當(dāng)多的對DNA有高親合力的染料可用于此應(yīng)

4、用。而不同的染料與DNA分子結(jié)合的位點(diǎn)不同?，F(xiàn)用得最多的兩種DNA結(jié)合染料是藍(lán)光激發(fā)的碘化匹啶（PI）（或偶爾也有用EB）和紫外激發(fā)的DAPI和Hoechst染料33342和33258。PI染料是一種插入性的與雙鏈DNA和RNA（當(dāng)要特異地檢測DNA時(shí)，經(jīng)常使用RNAse去除RNA）結(jié)合，而DAPI和Hoechst染料僅與DNA的螺旋結(jié)構(gòu)的亞級(jí)凹槽結(jié)合并與RNA完全沒有任何結(jié)合。Hoechst 33342是現(xiàn)唯一令人滿意的能對活細(xì)胞DNA時(shí)行染色的染料。其他一些染料在染色前需要破壞細(xì)胞膜，故經(jīng)常使用去污劑或低滲溶液處理或溶劑進(jìn)行固定（酒精）。*注意：使用溶劑進(jìn)行固定（如酒精）經(jīng)常會(huì)引起細(xì)胞聚集

5、，詳情見分析細(xì)胞聚集。當(dāng)運(yùn)用DNA結(jié)合熒光染料后，可觀察到一個(gè)有特征的圖譜，那就是由各種細(xì)胞組成的一個(gè)細(xì)胞周期分布圖。當(dāng)二倍體細(xì)胞被化學(xué)定量式DNA染料著色后并在流式細(xì)胞儀上分析，會(huì)觀察到一個(gè)很“窄”熒光峰。它將出現(xiàn)在以熒光強(qiáng)度為X軸、細(xì)胞數(shù)量為Y軸的坐標(biāo)上。因?yàn)榉N種原因G1期細(xì)胞具有相同的DNA含量，理論上G1期細(xì)胞的DNA含量熒光強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)一致，并在直方圖上的一個(gè)通道上出現(xiàn)信號(hào)（如圖2.2A中，在直方圖上出現(xiàn)一條G1期細(xì)胞的熒光直線）。圖2.2分別顯示了一個(gè)理想狀態(tài)中一臺(tái)完美的流式細(xì)胞儀無偏差檢測的直方圖（A）和實(shí)際分析得到的呈高斯分布的直方圖（B）。在B圖中，使用Dean 和 Jett 多

6、項(xiàng)式S期分析模型進(jìn)行分析識(shí)別出的G1、G2和S期細(xì)胞分布。如果流式細(xì)胞儀十分完美且DNA染料的特異性絕對專一，這種情況將會(huì)發(fā)生。而在實(shí)際中，流式細(xì)胞儀本身存在著許多變異性，此外DNA染料的著色也存在生物學(xué)的變異。因此，檢測得出的G1期細(xì)胞的熒光分布正常的是呈高斯曲線分布。這種“鐘”型分布與檢測的變異相關(guān)（圖2.2B）。檢測中的變異越大，高斯曲線的寬度越寬。有一個(gè)名為“變異系數(shù)”（CV）的指標(biāo)用于描述峰的寬度。CV是一種規(guī)格化的標(biāo)準(zhǔn)差，定義為CV=100*標(biāo)準(zhǔn)差/平均值。相類似，G2和M期細(xì)胞它們擁有兩部的正常G1期細(xì)胞的DNA含量，從而在直方圖上形成一個(gè)兩倍于G1信號(hào)峰D.I.2.0的高斯峰（

7、見圖2.2）。實(shí)際上，G2/G1的比值常小于2.0，可能是因?yàn)镚2期細(xì)胞的DNA-蛋白（染色質(zhì)）聚集得更緊密或更濃縮。從而DNA染料著色時(shí)與DNA位點(diǎn)的結(jié)合能力被削弱。最常見的G2/G1的比值是1.97。在理論上的完美流式細(xì)胞儀上檢測時(shí)，S期細(xì)胞將分布自所有G1期細(xì)胞直方圖右側(cè)并一至延伸到所有G2期細(xì)胞直方圖的左側(cè)。因?yàn)榧?xì)胞一旦開始進(jìn)入S期便會(huì)開始合成DNA，并緊帖著G1期細(xì)胞開始向外延伸。而后DNA含量不斷增加直至完成S期階段進(jìn)入G2期。不幸的是，實(shí)際中的直方圖分布并不是如此簡單，這是因?yàn)镚1、G2期的DNA峰分布并直線，而是有寬度的高斯分布，而S期分布則更寬。所形成的結(jié)果是早期S期細(xì)胞與G

8、1期細(xì)胞相互疊加，而后期S期細(xì)胞與G2期細(xì)胞相互疊加。區(qū)分這些疊加細(xì)胞而計(jì)算出正確的G1、S和G2期細(xì)胞是以下章節(jié)討論的內(nèi)容。二倍與異倍體細(xì)胞的DNA含量正如前面介紹的那樣，機(jī)體所有的G1期細(xì)胞，極少例外，都具有相同的DNA含量和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。在哺乳動(dòng)物中，每個(gè)染色體具有兩條構(gòu)成。這在細(xì)胞遺傳學(xué)者認(rèn)為是具有“雙重DNA含量”（根據(jù)實(shí)際觀察到的染色體數(shù)量）的細(xì)胞，并且定義了“2N”來描述它們（N是指單個(gè)染色數(shù)量，單倍染色體的DNA含量）。而流式細(xì)胞儀通常也有相關(guān)的術(shù)語來描述：“DNA指數(shù)（D.I.）1.0”來指代這些G1期細(xì)胞的DNA含量。具有其他DNA含量的細(xì)胞并意味著一定是屬于異常，如以上介紹

9、的S期和G2細(xì)胞和僅有單倍染色體生殖細(xì)胞，及一些在體內(nèi)具有四倍DNA含量（D.I.2.0）的細(xì)胞（其他例外情況，如存在少數(shù)多核細(xì)胞）。所有這些細(xì)胞的DNA都具有“整倍”關(guān)系，它們之間的差別都是以完整的染色體組為單位的，而這些染色體組中的各染色體都擁有其自身的完整性。任何DNA含量異常的細(xì)胞其染色體組首先發(fā)生的異變或致少染色體的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，這們將這些細(xì)胞稱為“異倍”DNA含量（針對于整倍體之言）。因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)胞或細(xì)胞核DNA流式細(xì)胞儀無法確切檢測出染色體數(shù)量，流式細(xì)胞儀無法確定哪些是DNA指數(shù)為1.0的正常細(xì)胞，所以要使用已知樣本來事先定義二倍體細(xì)胞。同樣的，當(dāng)細(xì)胞的DNA指數(shù)為2.0時(shí)我們稱

10、之為G2期細(xì)胞，或四倍體細(xì)胞或一個(gè)擁有異常DNA含量的異倍體細(xì)胞。在流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測時(shí)，它的位置事先也要精確地進(jìn)行定義。流式細(xì)胞儀通過觀察DNA指數(shù)為非1.0整倍的細(xì)胞而能檢測出染色體的變化，但這些細(xì)胞的染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量必須發(fā)生了改變。因?yàn)槊~“異倍體”實(shí)際是指通過染色體來確認(rèn)的，當(dāng)我們通過流式細(xì)胞儀檢測DNA含量來發(fā)現(xiàn)它們時(shí)，要以“DNA-異倍體”來形容它們。DNA異倍體細(xì)胞通常，但非絕對，與惡性組織有關(guān)系。但一些例外情況必須注意，如一些良性腫瘤（如內(nèi)分泌腺腫瘤）和惡變前的上皮細(xì)胞。當(dāng)一個(gè)惡性腫瘤通過流式細(xì)胞儀DNA-異倍體峰檢測出來時(shí)，直方圖分析時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)在腫瘤中異倍體細(xì)胞與二倍體細(xì)胞相

11、互混合。二倍體細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、纖維原細(xì)胞和一些基質(zhì)成份，它們經(jīng)常在樣本中占一定的數(shù)量。腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞都會(huì)有部分細(xì)胞正在進(jìn)行細(xì)胞循環(huán)過程，經(jīng)歷著G1 S G2 M期（基質(zhì)細(xì)胞的S和G2期細(xì)胞數(shù)量通常比惡性細(xì)胞的要少得多），所以此時(shí)得到的DNA直方圖通常是由兩個(gè)細(xì)胞循環(huán)相互疊加構(gòu)成的，但MultiCycle和ModFit都有專門的模型對它們進(jìn)行分析。細(xì)胞周期分析和DNA含量直方圖 DNA直方圖要求數(shù)學(xué)方法來進(jìn)行分析目的是精確地識(shí)別出被覆蓋的G1、S和G2期細(xì)胞的分布；這些分析方法已經(jīng)歷了過去二十多年的發(fā)展與完善。從DNA含量直方圖中提煉出細(xì)胞周期圖的方法也從簡單的圖形識(shí)別發(fā)展到更為復(fù)雜

12、的曲線擬合。所有簡單分析方法都是基于G1和G2期細(xì)胞與S期之間疊加很少，G1和G2期細(xì)胞數(shù)量與直方圖上檢測到的G1、G2期數(shù)量接近的假設(shè)。有兩種具體計(jì)算方法。第一種是通過計(jì)算G1期曲線的左半部分和G2期曲線的右半部分，然后翻倍后得出G1、G2期細(xì)胞，而剩余部分便是S期細(xì)胞。第二種方法是只利用最中間的S期細(xì)胞分布，并向左側(cè)G1期平均熒光強(qiáng)度和右側(cè)G2期平均強(qiáng)度延伸而計(jì)算出S期細(xì)胞。而左、右側(cè)剩余部分便分別是G1和G2期細(xì)胞。這些方法僅在只有一個(gè)細(xì)胞循環(huán)周期的直方圖上才能得出比較準(zhǔn)的結(jié)果。以上兩種方法都假設(shè)G1和G2峰是左右對稱的（實(shí)際上不同組織染色后并不形成這種對稱峰）并且兩峰的中間點(diǎn)能夠被精確

13、地識(shí)別出來。然而由于G1和G2峰與S期峰總是相互疊加的，所以這些峰的平均值往往并不在它們的最高點(diǎn)上，特別是G2峰。如果存在第二個(gè)細(xì)胞周期時(shí)，兩種周期的細(xì)胞相互疊加從而使這種分析方式變得很不可靠。此外，在這種簡單的圖形分析方法通常不對細(xì)胞碎片和細(xì)胞聚集建立模型進(jìn)行排除。更具柔性和精確的細(xì)胞周期分析方法是基于用數(shù)學(xué)方法構(gòu)造出的DNA含量分布圖，然后使用曲線擬合方法將這些模型與數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配。建立得最好的模型是由Dean和Jett在1974年通過預(yù)言細(xì)胞周期直方圖是呈高斯分布的理論而建立的。相互疊加的G1、G2峰和S峰可用高斯曲線重新被描述出來。在最初的提議中，增寬的S期分布是由一個(gè)光滑的二次冪拋物線

14、方程來描述的（拋物線的一個(gè)部分，y = a + bx + cx2）。這個(gè)模型可以被簡化為一次冪曲線（一個(gè)增寬的梯型，如以一條直線方程，y = a + bx）或零度斜線（一個(gè)增寬的矩型，直線模型，y = a）來擬合。當(dāng)直方圖的質(zhì)量與理想中相差太大時(shí)，特別是G1或G2峰不呈高斯曲線分布時(shí)（底部增寬，傾斜或存在肩峰），簡化模型可減少引起G1、S、G2峰疊加的影響。正如下面章節(jié)將要討論的那樣，這種情況經(jīng)常出現(xiàn)在臨床樣本中。在這種情況下，建意使用保守的零次冪或一次冪來擬后S期，除非對直方圖的質(zhì)量高度可靠可選用二次冪。有些實(shí)驗(yàn)驅(qū)動(dòng)形成的S期（通常是培養(yǎng)細(xì)胞）分布將會(huì)更復(fù)雜些，一些可選的分析模型可運(yùn)用于這些

15、分布。最為適合的模型是將S期切割成一系列的高斯曲線，然后計(jì)算這些曲線的和。在這個(gè)模型中，每個(gè)高斯曲線都可達(dá)到任意高度。因此S期可被完全地描述出來，故此模型適用于一些復(fù)雜的S期圖型。以上這些模型的優(yōu)點(diǎn)也是在實(shí)踐中的主要缺點(diǎn)。相當(dāng)靈活的描述S期峰型時(shí)會(huì)將任何人為造成的假數(shù)據(jù)也描述出來，并且還會(huì)增加近G1、G2期端的S期區(qū)域模糊性。一個(gè)比較折中的解決辦法是由Fox (1980)提出的，他在Dean和Jett的多項(xiàng)式S期模型中再增加了一個(gè)高斯曲線。Fox的模型能夠較好地描述S期圖型并同時(shí)又保持了S期曲線的平整性。它特別適用于分析經(jīng)藥物干預(yù)后形成的高S期細(xì)胞。Fox模型整合在MultiCycle軟件中，

16、其名稱為“Synchronous S”。使用二次冪曲線模型幾乎可擬合所有直方圖數(shù)據(jù)。擬合模型可生成數(shù)學(xué)表達(dá)式或函數(shù)來計(jì)算直方圖中各期細(xì)胞的分布。表達(dá)式中有一系列的參數(shù)（通常在7至22），它們必須被調(diào)整從而給出最與原始數(shù)據(jù)一致的模型。因?yàn)槟Ｐ褪沟暮瘮?shù)并非簡單的線性方程，而是非線性的二次冪函數(shù)。對于這種二次冪函數(shù)分析方法和相應(yīng)的計(jì)算機(jī)程序最初由Bevington (1969)提出。最為通用此類分析方法是由Marquardt (1963)提出的。所有的二次冪擬合技術(shù)都是帶自修整功能的：擬合函數(shù)模型中的參數(shù)能自動(dòng)修正從而可得出與原始數(shù)據(jù)最為貼近的方程，最終模擬出最接近的圖型。當(dāng)修正過程中無更優(yōu)方案出現(xiàn)

17、時(shí)，計(jì)算便會(huì)停止并得出理論上的最佳方案。擬合的優(yōu)度使用卡方檢測來驗(yàn)證，或是它的簡化公式：來求證，它可檢測擬合數(shù)據(jù)與實(shí)際數(shù)據(jù)的離散程度。二次冪擬合的速度是由尋找并發(fā)現(xiàn)最佳擬合參數(shù)的效率來決定的。馬夸特運(yùn)算方法會(huì)使用優(yōu)化的方案來尋找最低卡方值及最佳的擬合參數(shù)。二次冪擬合方法的優(yōu)點(diǎn)這種模型可以直接分析有兩個(gè)甚至三個(gè)細(xì)胞周期相互疊加的樣本。疊加模式分析部分是運(yùn)用去卷積的數(shù)學(xué)方法來統(tǒng)計(jì)單個(gè)細(xì)胞周期的。二次冪擬合方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在擬合過程中它被分析時(shí)的起點(diǎn)等參數(shù)的影響較小。這些參數(shù)包括人為定義的細(xì)胞峰算術(shù)平均位置和CVs值，及直方圖所分析區(qū)域的范圍。當(dāng)細(xì)胞周期和碎片分析模型能最優(yōu)化地?cái)M合數(shù)據(jù)時(shí)，分析結(jié)果

18、幾乎不受起始參數(shù)和相關(guān)人員操作的影響。有一點(diǎn)需充分認(rèn)識(shí)：從腫瘤組織中獲得的DNA含量直方圖經(jīng)常較正常直方圖相去甚遠(yuǎn)（高CVs值，多碎片和細(xì)胞聚集）或更加復(fù)雜（出現(xiàn)幾個(gè)相互疊加的細(xì)胞周期），并經(jīng)常出現(xiàn)意料之外的峰型（如，偏峰及非高斯分布峰型）。這些情況在福爾馬林固定的樣本中更為多見。當(dāng)一個(gè)偏向的G1峰或帶有尾峰的G1，其右側(cè)延伸至S期時(shí)，對S期細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)應(yīng)格外小心。在分析這些不典型直方圖時(shí)的一個(gè)重要方面是通過簡化假設(shè)來減少模型的擬合參數(shù)而降低分析模型的復(fù)雜性。這可能會(huì)降低模型對直方圖細(xì)節(jié)的分析能力，但它同樣也降低了錯(cuò)誤分析數(shù)據(jù)的可能性。如上所述，有些模型可能會(huì)假設(shè)一個(gè)偏態(tài)的或低部過寬的G0或G1

19、峰是S期的一個(gè)部分，從而引起了真正S期細(xì)胞的過量統(tǒng)計(jì)。一些更保守的模型在分析，因多個(gè)細(xì)胞峰相互疊加或聚集細(xì)胞和細(xì)胞碎片過多時(shí)而引起的CVs過寬或細(xì)胞峰未很好分離的樣本時(shí)，它的精度會(huì)更好。這些情況將在以下的章節(jié)中進(jìn)行討論。在以上情況下推薦使用Dean和Jett的計(jì)算方法中零次冪（加寬矩形）或一次冪（加寬的四邊形）來替代較為靈活但更易出錯(cuò)的二次冪模型。此外還可強(qiáng)制規(guī)定G2和G1期峰的CVs值相等（它們通常下是相當(dāng)接近的），或規(guī)定二倍體細(xì)胞的CVs值與異倍峰的相等，或根據(jù)以往實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)提供G2/G1的比值。請參考第8章-擬合選項(xiàng)，來獲得更多的相關(guān)信息。最后，下面將介紹，仔細(xì)地?cái)M合細(xì)胞聚集和碎片背景也

20、是在分析復(fù)雜直方圖中獲得最佳細(xì)胞周期結(jié)果的重要方面。擬合“碎片” 及細(xì)胞核切割物背景幾乎所有作流式細(xì)胞儀DNA含量分析的細(xì)胞或細(xì)胞核懸液都存在一些被破壞或損壞的細(xì)胞核（碎片），它們通常分布在二倍體G1期的左側(cè)。當(dāng)樣本源自于新鮮組織或細(xì)胞，這些碎片信號(hào)會(huì)出現(xiàn)在直方圖的左邊界并迅速回落至底線。在理想狀態(tài)下，碎片信號(hào)并不會(huì)影響細(xì)胞周期直方圖。然而實(shí)際中卻非如此，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)用計(jì)算機(jī)擬合碎片分布并去除其對細(xì)胞周期各峰的影響至關(guān)重要。傳統(tǒng)的碎片擬合假設(shè)是碎片曲線從高峰迅速回落至底線并可用一個(gè)指數(shù)函數(shù)(e-kx)來擬合。但是其中存在兩大原因而造成了指數(shù)曲線擬合并不能精確模擬出碎片的分布：1）許多碎片分布并不是

21、真正成指數(shù)曲線分布的。而一個(gè)從高峰迅速回落至一定高度后進(jìn)入一個(gè)緩慢回落或平臺(tái)過程的情況卻最為多見。這個(gè)較為緩慢的回落部分對細(xì)胞周期的影響比指數(shù)曲線預(yù)測的影響要大得多。2) 碎片是因?yàn)榧?xì)胞被溶解、破碎或細(xì)胞核被切割而造成的，所以它們只向DNA峰的左側(cè)延伸（微小DNA含量峰）。因此，碎片峰的形態(tài)是依靠于DNA直方圖中個(gè)峰位置的，并且碎片不可能獨(dú)立于細(xì)胞細(xì)胞峰之外。因?yàn)镾期是細(xì)胞周期中含量最低分布最廣的部分，S期的計(jì)算受以上影響最大。圖2.3. 擬合石蠟包埋組織二倍體細(xì)胞。（A）使用簡單指數(shù)曲線擬合碎片曲線，（B）直方圖依靠，指數(shù)似后，（C）切核模式擬合碎片。如圖所示各種分析方法對細(xì)胞周期中S期的影

22、響各不相同。簡單指數(shù)擬合開始點(diǎn)從碎片的最左側(cè)開始至接近于G1峰，如圖（D），所得出的S期檢測結(jié)果與（A）圖中差別很大。圖（E）顯示窄范圍直方圖依賴性指數(shù)碎片擬合，得出的S期細(xì)胞比圖（B）要少22%。相比而言，切核模式擬合的結(jié)果受改變分析區(qū)域的影響最小，如圖（E）。為了演示以上兩種觀點(diǎn)，可以試用不同的模型來分析由石蠟包埋組織提取細(xì)胞的DNA直方圖。圖2.3A顯示了以一個(gè)簡單的指數(shù)曲線來擬合G1期峰左側(cè)的碎片。這種模式并沒有識(shí)別出許多混入G1期的碎片，根據(jù)分析區(qū)域的不同過多或過少地預(yù)測了混入S和G2期峰內(nèi)的碎片。在MultiCycle中整合了一個(gè)更為成熟的指數(shù)模型來擬合碎片。在此要意識(shí)到DNA碎片

23、是從DNA陽性峰開始只向左側(cè)延伸，MultiCycle中的模型假設(shè)每個(gè)DNA陽性峰都會(huì)產(chǎn)生一定的碎片并向左側(cè)延伸。因?yàn)镈NA含量峰左側(cè)從零到陽性出現(xiàn)的左側(cè)與右側(cè)直方圖的坐標(biāo)長度不同，所以MultiCycle指數(shù)曲線會(huì)擬合出一個(gè)看似“陡峭”的曲線，并且它的后端將延續(xù)覆蓋很多通道并因下降速度不同而出肩峰。MultiCycle 中的“直方圖依賴”性指數(shù)模型的運(yùn)用結(jié)果如圖2.3B和2.3E。在這兩個(gè)例子中，因數(shù)據(jù)中絕大部分細(xì)胞都屬于G1期，背景碎片曲線由G1峰的左側(cè)向右側(cè)迅速下降。圖2.3E顯示了在近G1峰處擬合碎片的曲線，而2.3B顯示了遠(yuǎn)G1峰的擬合曲線。因?yàn)榇怂槠瑪M合曲線并不是真正的指數(shù)函數(shù)，所

24、以選擇的分析區(qū)域不同得出的曲線也不同。S期的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)也不相同，2.3B與2.3E圖中S期值分別是4.1%和3.2%。從有利的方面分析，這個(gè)模型比簡單的指數(shù)模型要更有效。然而使用一個(gè)可對經(jīng)切片機(jī)處理過和石蠟組織所形成的碎片專門分析的模型可得到一個(gè)更佳的分析結(jié)果。此模型可擬合碎片曲線的任何部分，并且它并不受不同分析區(qū)域的影響，圖2.3C和2.3F顯示該模型的結(jié)果。這個(gè)模型在分析石蠟切片樣本時(shí)特別有效，詳情見下文。分析石蠟組織在流式細(xì)胞儀DNA檢測應(yīng)用中變得越來越重要。它不僅可對這類樣本進(jìn)行回顧性研究，從而使流式細(xì)胞儀分析結(jié)果與病人長期追蹤建立關(guān)系，而且在許多新鮮組織不可用的情況下分析石蠟標(biāo)本已作為臨床檢測的重要來源。為了取得有效的細(xì)胞周期信息，在分離細(xì)胞核及選擇細(xì)胞周期分析模型時(shí)要特別注意。作為從石蠟組織中提取細(xì)胞的一個(gè)步驟，組織塊通常要用切片機(jī)將組織切成近50 m 的薄片，從而不可避免出現(xiàn)細(xì)胞核碎片。這些細(xì)胞核碎片將影響S期細(xì)胞的計(jì)算，但使用一個(gè)可分析切核的模型來分析碎核可有助于糾正這些影響?？梢韵胂笤谇衅瑱C(jī)刀片軌道上的細(xì)胞核將被隨機(jī)地切成兩個(gè)部分。如果將細(xì)胞核簡單地想象成球形體并被垂直地