抗人Fas單克隆抗體的制備及鑒定

1、抗人Fas單克隆抗體的制備及鑒定*Fas/Apo1/CD95抗原的發(fā)現(xiàn),始于對兩株單克隆抗體(mAb)的功能觀察，即抗Apo1mAb和抗FasmAb1，2。由于二者都能識別細胞膜上CD95蛋白抗原，且能誘導敏感細胞凋亡，才導致今天對Fas抗原的生物醫(yī)學研究。制備抗Fas mAb對于Fas抗原的深入研究，尤其是對Fas抗原信號傳導機制的闡明，以及生物醫(yī)學應用都有重要的意義。本文利用Fas的細胞作為免疫原，制備了1株鼠抗人Fas mAb 2A1。1材料和方法1.1材料1.1.1細胞系Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞、Jurkat人T淋巴細胞性白血病細胞、Raji人Burkitt（非州）淋巴瘤細胞及U937

2、人組織細胞性淋巴瘤細胞，均為本室保存。THP1人單核白血病細胞，引自中國科學院上海細胞生物所。各細胞系均在含10NCS的RPMI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)傳代。1.1.2動物Balb/c雌性純系小鼠，68周齡，由本校實驗動物中心收提供。1.1.3主要試劑單特異性兔抗人Fas多克隆抗體（PcAb）N18，購自SantaCruz公司。鼠抗人FasmAbCH11(Kamiya公司產(chǎn)品)，為我室訪美學者鄭力新贈送。HRP羊抗兔IgG及HRP羊抗鼠IgG，購自華美公司。鼠Ig類與亞類及型檢測試劑盒：IsoStripTMkit,購自BM公司。硝酸纖維膜（NC膜），為Gibco公司產(chǎn)品?？扇苄灾亟M人Fas胞外

3、區(qū)蛋白（SrFasTM），購自PharMingen公司。1.2方法1.2.1抗人Fas mAb的制備動物免疫：以Jurkat細胞為免疫原，基礎免疫為Ba1b/c小鼠腹腔注射0.2ml（含2107個細胞/鼠），免疫2次，間隔2wk4wk。加強免疫為每脾注射0.1ml（含1106個細胞/脾），3d后融合。細胞融合、篩選及克隆化：小鼠脾細胞先用2.5mol/LLeuOMe處理，再與Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞按10：1的比例，以50PEG進行融合3。融合后10d15d，取上清進行篩選。將雜交瘤上清對Jurkat細胞的生長有毒性作用的孔，初步定為陽性孔。克隆及亞克隆化，采用有限稀釋法。腹水制備及mAb的純

4、化：常規(guī)制備腹水，采用鹽析和DEAE纖維素層析相結合純化mAb。1.2.2mAb的鑒定DotELISA:將SrFas抗原標準品點樣于NC膜上，1BSA封閉后，相繼滴加雜交瘤腹水和HRP羊抗鼠IgG，用DAB顯色。實驗中以抗人FasmAbCH11作為陽性對照。Westernblot:Fas敏感細胞用PBS洗滌后，用三去污劑裂解液（含50mol/LTris?C1，pH8.0，150mmol/LNaCl,0.02NaN3,0.1SDS,100mg/LPMSF,1g/mlAprotinin,1NP40及0.5脫氧膽酸鈉）抽提膜蛋白4。經(jīng)12SDSPAGE分離，轉移至NC膜后，相繼與雜交瘤腹水和HRP?

5、羊抗鼠IgG起作用，DAB顯色。Ig類與亞類及型鑒定：按Boehringer Mannheim公司生產(chǎn)的IsoStripTM試劑盒說明進行。2結果2.1雜交瘤細胞系的建立用Jurkat細胞作為免疫原，分批免疫Balb/c小鼠，經(jīng)8次融合，篩選出對Jurkat細胞生長有抑制/毒性作用的孔3個，經(jīng)克隆及反復亞克隆化后，分別命名為2A1，3B6和3D1。制備上清和小鼠腹水。2.2mAb的鑒定經(jīng)復孔試驗，對雜交瘤細胞系2A1，3B6和3D1腹水測試發(fā)現(xiàn)，僅2A1能與SrFas蛋白起反應，斑點陽性對照（抗FasmAbCH11）亦能與SrFas結合并顯色，Sp2/0細胞誘生的腹水則呈陰性（1見第頁）。免疫

6、印跡：Jurkat細胞、Raji細胞及THP1細胞膜蛋白提取樣品經(jīng)SDSPAGE后，用考馬斯亮蘭R250染色液染色及脫色后，顯示蛋白條帶相似，與U937細胞膜蛋白條帶差異明顯（2第頁）。經(jīng)電轉印及免疫染色后發(fā)現(xiàn)，mAb2A1腹水能與Jurkat細胞、Raji細胞和THP1細胞膜蛋白中相對分子質(zhì)量（Mr）為50000左右的蛋白帶起反應，與特異性兔抗人FasPcAbN18所識別的位置一致（3見第頁），但在U937細胞膜蛋白帶上未能檢出陽性結果。Ig類、亞類及型的鑒定：從BM公司試劑盒檢測條帶上顯示mAb2A1為IgG1()。1斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗1：mAb2A1；2：mAb3B6；3：mAb3D1

7、；4：抗Fas mAbCH-11;5:Sp2/0細胞誘生的腹水2Jurkat,Raji及THP-1細胞膜蛋白的SDS-PAGE(A)1：U937細胞；2：Jarkat細胞；3:Marker(Mr);4:Raji細胞；5：THP-1細胞；(B)1,3:Jurkat細胞;2:Marker(Mr)3免疫印跡1：Marker(Mr);2:抗Fas PcAb N-18;3:mAb 2A1;4：抗SrFas的mAb 2A1；5：Sp2/0細胞的培養(yǎng)上清3討論對Fas抗原分子的研究，開始于抗FasmAb的制備，而正是由于制備了抗Fas mAb才有了今天對Fas抗原較深入地認識?？笷as mAb能誘導Fas敏

8、感細胞凋亡，有關Fas抗原死亡信號傳導等的研究也離不開抗Fas mAb的作用。Fas抗原作為細胞膜表面受體，其抗原來源有限，這是抗FasmAb制備過程中的一大障礙。在制備抗Fas mAb時，曾有3種方案用來解決抗原量不足的問題：用生物化學方法，從Fas細胞膜上純化Fas蛋白抗原；用化學方法，合成Fas抗原胞外區(qū)肽段；用Fas細胞直接作為免疫原。開始我們曾提取Fas細胞的膜蛋白，試從中純化出部分Fas蛋白抗原，但由于純化量太低且方法繁瑣，以及考慮到純化的Fas抗原蛋白的變性，制備出的抗FasmAb是否具有生物學活性等原因，而放棄了第1種方法。用合成肽作為抗原，制備抗Fas mAb是最為簡便而有效

9、的方法，但由于合成過程中剛好遇上國際上某些合成用的化學試劑禁運，使這種方法亦被迫停止。因此，我們制備抗Fas mAb采用的是第3種方法，即用Fas細胞作為免疫原，采用功能檢測的方法篩選有生物學活性的抗Fas mAb。Fas細胞采用Jurkat T淋巴細胞性白血病細胞，是因為83的Jurkat細胞膜表面Fas抗原表達陽性，比例較高1；且Jurkat細胞繁殖較快，傳代容易，易于大量收集用于制備免疫原。另外，我們的實驗還證實，Jurkat細胞用PHA或ConA均不能提高其細胞膜表面Fas抗原的表達量，這與國外某些實驗室的結果一致（鄭立新，美國NIH）。用Jurkat細胞作為免疫原免疫Balb/c小鼠

10、制備mAb，細胞融合率不超過75。為了提高融合率，我們曾將Sp2/0骨髓瘤細胞用20g/ml的8氮雜鳥嘌呤處理，并用小鼠活體內(nèi)生長的骨髓瘤細胞進行融合，但效果不理想5。而用Leu?OMe處理免疫脾細胞后再與Sp2/0細胞融合，則能明顯提高融合率(達90)以上，但其機理不詳3。用功能檢測來篩選陽性雜交瘤，在制備抗FasmAb過程中雖費時、費力，但在沒有足夠純化Fas抗原的情況下亦還有效。研制出有生物學活性的抗Fas mAb，即能誘導Fas敏感細胞凋亡，換言之，即對細胞的生長有抑制作用或毒性。為此，我們對幾千個融合的陽性雜交瘤上清進行了檢測，最終篩選到3個對Fas敏感細胞有毒性作用的孔，經(jīng)篩選和克

11、隆化獲得1株抗人FasmAb。*全軍“九五”醫(yī)藥衛(wèi)生科研重點基金資助項目，No.96Z038作者簡介：宋建勛，男，31歲，講師，博士。重慶市高灘巖正街30號，Tel.(023)68752274作者單位：第三軍醫(yī)大學全軍免疫學研究所，重慶，400038參考文獻1Trauth BC, Klas C, Peters AM, et al. Monoclonal antibody mediated tumor regression by induction of apoptosis. Science, 1989; 245(4915): 301304 2Yonehara S, Ishii A, Yoneh

12、ara M. A cell-killing monoclonal antibody(anti-Fas) to a cell surface antigen co-downregulated with the receptor of tumor necrosis factor. J Exp Med, 1989; 169(5):17471756 3Seo N, Egawa K. Utilization of leucine methyl ester for the generation of hybridomas producing monoclonal antibodies specific to rumor-associated a