沙門菌檢查法

1、沙門菌檢查法1簡述沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌，按Bergey系統(tǒng)細菌學(xué)手冊第一卷（1984）,沙門菌分5個亞屬。2003年出版的第八版的臨床微生物 手冊將沙門菌屬分成兩個菌種即腸炎沙門菌和乍得沙門菌，其中腸炎沙門菌分6個亞種，包括常見的傷寒、甲型副傷寒、乙型副傷寒、丙 型副傷寒、，鼠傷寒，豬霍亂等沙門菌雜內(nèi)，迄今已發(fā)現(xiàn)2501個血清 型。O抗原抗血清A-E群包含了沙門菌分離株的95%所以常用沙門 菌A-F O多價血清進行沙門菌初篩試驗。藥品中的沙門菌，是以鑒定 沙門菌屬為準(zhǔn)，即對沒10g（或10ml）藥品中是否檢出沙門菌作出檢 驗報告。由于沙門菌血清型繁多，各血清型的生化及血清學(xué)特性雖密切

2、相 關(guān)，卻不盡相同，采用一種增菌培養(yǎng)基和兩種分離培養(yǎng)基，不可能涵 蓋所有沙門菌的最適增菌及分離條件。此外，由于藥品在生產(chǎn)過程中，常受到加熱、干燥等加工步驟的 影響，藥品中污染的沙門菌可受到損傷或呈休眠狀態(tài)，故須在增菌培養(yǎng)前先進行預(yù)增菌。然后再進行增菌及分離、三糖鐵瓊脂初步鑒別、 生化試驗、血清學(xué)試驗等步驟。2儀器、設(shè)備及用具（見大腸埃希菌2）。3試液指示液（參見大腸埃希菌3）3.1無菌脲試液附錄2.5。3.2酚磺酞指示液附錄4.4。3.3亮綠試液附錄2.9。3.4氰化鉀試液附錄2.14。3.5溴甲酚紫指示液附錄4.5。3.6革蘭染色液附錄2.4,2.10,2.16。3.7沙門菌屬A-F“O多價

3、血清（即O多價1）生物制品研究所供應(yīng)。4培養(yǎng)基4.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基附錄5.2。4.2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基附錄5.1。4.3半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基附錄5.3。4.4曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基（EMB 附錄5.8。4.5麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC 附錄5.9。4.6四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB 附錄5.11。4.7三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）附錄5.10。4.8膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL 附錄5.13。4.9沙門菌屬志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS 附錄5.12。4.10蛋白胨水培養(yǎng)基附錄5.18。4.11脲（尿素）瓊脂培養(yǎng)基附錄5.23。4.12氰化鉀培養(yǎng)基附錄5.24。4.13賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基附錄5.25。5對照用

4、菌液取乙型副傷寒沙門菌CMCC（B）50094是營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，36C士1C培養(yǎng)1824h后，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至1:106（濃度相當(dāng)于50100cfu/0.1ml）,作 陽性對照用菌液。其菌液濃度可用平板菌落計數(shù)法測得。即取0.1ml加入平皿內(nèi)，傾注營養(yǎng)瓊脂，混勻，或以0.1ml均勻涂布于事先準(zhǔn)備 好的營養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)培養(yǎng)后點計求得。6操作方法6.1準(zhǔn)備工作：（見細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)6）。6.2供試液的制備：（見細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)7）。含抑菌成分供試品供試液的制備：（見大腸埃希菌6.2）。6.3陽性對照實驗、陰性對照實驗（見大腸埃希菌7

5、.1）。6.4增菌培養(yǎng)6.4.1預(yù)增菌 取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基2份，每份200ml，1份加入10g或者10ml供試品使勻，另1份加入稀釋劑10ml作陰性對照，36C士1C培養(yǎng)1824h,觀察。搖動陰性對照瓶后應(yīng)清亮透明，無 菌生長。6.4.2增菌培養(yǎng) 輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)瓶，吸取1ml接種于1管 含10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)1824h。6.5分離培養(yǎng) 輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)，以接種環(huán)沾取12環(huán)培 養(yǎng)液劃線于膽鹽硫乳瓊脂（DHL或沙門菌志賀菌瓊脂（SS平板及 曙紅亞甲藍（EMB瓊脂或麥康凱瓊脂平板各1個，倒置培養(yǎng)2448h。 檢查平板上有無疑似沙門菌菌落。沙門菌在上述平板上的菌落形態(tài)

6、特 征見表1表1沙門菌的菌落特征菌落形態(tài)黑色或全部黑色或無黑色沙門菌屬志賀菌屬瓊脂（SS）無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色濕潤的圓形菌落中心有時為暗色由于沙門菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產(chǎn)酸，菌落不著色，一般為無色半 透明，多數(shù)沙門菌因產(chǎn)生H2S,菌落中心呈現(xiàn)黑色甚至全黑色，在DHL瓊脂平板上較為明顯。在SS瓊脂平板上，HS特征有時不明顯，沙門 菌屬亞屬皿因多數(shù)菌株發(fā)酵乳糖，故在上述平板上的乳糖發(fā)酵菌落呈 現(xiàn)粉紅或紫色，但由于產(chǎn)生HS,在有H2S指示系統(tǒng)的平板上仍出現(xiàn) 黑色中心。在上述培養(yǎng)基上，有些非沙門菌屬細菌，也可呈現(xiàn)類似沙 門菌菌落形態(tài)， 須進一步鑒別。 由于藥物的影響或非典

7、型菌株的存在，沙門菌菌落可呈現(xiàn)非典型形態(tài)，如色澤變深，菌落粗糙等，應(yīng)注意辨 別。6.6初步鑒別試驗從每個供試品的分離平板上挑取23個疑似菌落（菌落形態(tài)特征與 表1所列的形態(tài)特征相符或疑似）分別接種于三糖鐵瓊脂斜面，接種 時應(yīng)以接種針輕輕接觸單個菌落中心部位， 沾取培養(yǎng)物劃線于三糖鐵瓊脂斜面并穿刺到底層或先穿刺底層再劃線斜面，培養(yǎng)1824h,觀膽鹽硫乳瓊脂（DHL無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶平板曙紅亞甲藍瓊脂（EMB無色至淺橙色，透明或半透明，光滑麥康凱瓊脂（MacC無色至淺橙色，透明或半透明，菌落察結(jié)果。疑似沙門菌在三糖鐵瓊脂斜面上的反應(yīng)為：斜面紅色（產(chǎn)堿）， 底層黑色（產(chǎn)H2S）并顯示黃

8、色（產(chǎn)酸）；斜面紅色，底層黃色； 斜面黃色，底層黑色，并顯示黃色。多數(shù)沙門菌在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)生 氣體，使底層瓊脂出現(xiàn)氣泡或使瓊脂斷裂，但也有不產(chǎn)生氣體的菌種。 對在三糖鐵瓊脂斜面黃色并同時底層無黑色， 或斜面及底層均為紅色 者可以排除沙門菌。將疑似沙門菌的三糖鐵瓊脂或營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作生化試驗， 血清凝集試驗及革蘭染色，鏡檢。沙門菌應(yīng)為革蘭性桿菌。6.7生化試驗6.7.1靛基質(zhì)試驗 用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種到蛋白胨水培養(yǎng) 基中，照大腸埃希菌靛基質(zhì)試驗項下操作、判斷結(jié)果。沙門菌應(yīng)為陰 性反應(yīng)。6.7.2脲酶試驗 用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，劃線接種于脲瓊脂斜 面，培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。斜面變?yōu)?/p>

9、紅色為陽性反應(yīng)，沙門菌屬為陰 性反應(yīng)。6.7.3氰化鉀試驗 竟培養(yǎng)物先接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)2024h,用接種環(huán)沾取培養(yǎng)液1環(huán)，接種至氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，另取一環(huán) 培養(yǎng)液接種于不含氰化鉀的同樣培養(yǎng)基內(nèi)作對照管，接種后即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng)2448h，觀察結(jié)果。對照管內(nèi)有菌生長（渾濁），而 試驗管也有菌生長為陽性反應(yīng)；對照管有菌生長（渾濁）而試驗管無菌生長（清亮）為陰性反應(yīng)。沙門菌應(yīng)為陰性反應(yīng)。本試驗應(yīng)十分注意密封管口，夏天分裝培養(yǎng)基宜在冰浴中進行， 防止氯化鉀分解，產(chǎn)生氫氰酸逸出，致使培養(yǎng)基內(nèi)氰化鉀濃度降低， 不能抑制細菌生長，造成假陽性。氰化鉀為劇毒品、操作時須謹(jǐn)慎，切勿用口吸液。用后的培養(yǎng)基

10、, 每管加數(shù)粒硫酸亞鐵和20癟氧化鉀0.5ml，去毒，然后再滅菌，洗 滌。6.7.4賴氨酸脫羧酶試驗 用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種在賴氨酸 脫羧酶培養(yǎng)基中， 同時接種一支不含賴氨酸的同樣培養(yǎng)基作為對照 管，培養(yǎng)2448h觀察結(jié)果。對照管黃色（產(chǎn)酸），試驗管呈紫色為 陽性反應(yīng)（賴氨酸脫羧酶產(chǎn)堿）；試驗管黃色為陰性反應(yīng)。沙門菌應(yīng) 為陽性反應(yīng)。6.7.5動力試驗用接種針沾取培養(yǎng)物， 穿刺接種于半固體營養(yǎng)瓊脂 管中， 培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。有動力的細菌能在穿刺線以外的培養(yǎng)基 內(nèi)擴散生長使培養(yǎng)基呈渾濁現(xiàn)象；無動力的細菌僅能沿穿刺線生長， 不向外擴散，培養(yǎng)基仍呈清晰透明狀；無動力表現(xiàn)的培養(yǎng)物，應(yīng)在室 溫保

11、留23天后，再行觀察。沙門菌除雞雛沙門菌及無動力的變種 外，均具有周身鞭毛，能運動，動力試驗陽性。沙門菌生化反應(yīng)的初步鑒別見表2表2沙門菌與有關(guān)細菌在三糖鐵瓊脂及初步生化試驗的鑒別三糖鐵瓊脂斜面產(chǎn)層產(chǎn)氣硫化靛脲氰賴氨基酶化酸脫判定菌屬號氫質(zhì)鉀羧酶1.1+/+/+沙門菌屬1.2+/+沙門菌屬皿2+/+緩慢愛德華菌屬3+/+/+/+/+/弗勞地檸檬酸桿菌4.1一+S+一+一奇異變形桿菌4.2+/S+普通變形桿菌5+/+/+/+/大腸埃希桿菌6+/+志賀菌屬7.1+一一+/+一陰溝腸桿菌一7.2+/+肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌8+S/+/+普羅菲登斯菌屬、摩根菌屬9+/+蜂房哈夫尼亞菌、粘質(zhì)沙雷菌注：

12、+產(chǎn)酸（黃色），陽性，陽性率90%產(chǎn)堿（紅色），陰性，陰 性率90%+/ 多數(shù)陽性、少數(shù)陰性；+S產(chǎn)生少量氣體（本表依 據(jù)何曉青衛(wèi)生防疫細菌檢驗參考第八版美國臨床微生物手冊）；反應(yīng)序號1.1不產(chǎn)HS可結(jié)合血清學(xué)凝集試驗，或加做部分生化試驗， 判定為沙門菌；反應(yīng)序號1除典型反應(yīng)外，脲酶、氰化鉀試驗、賴氨 酸脫羧酶試驗三項中有一項異常；反應(yīng)序號2僅靛基質(zhì)陽性。其他情 況可排除沙門菌。6.8血清學(xué)凝集試驗6.8.1準(zhǔn)備1片潔凈的滅菌載玻片，在近中央的一端，以直徑3mm接 種環(huán)沾取沙門菌屬O多價1血清23環(huán)制成與玻片橫徑相垂直的條 形涂抹， 長約1.5cm,寬約0.5cm。另一端用生理鹽水代替血清同法

13、 操作，作為陰性對照。682用接種環(huán)分別挑取三糖鐵瓊脂斜面或營養(yǎng)瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物少許，在血清和鹽水中混勻。菌量要適當(dāng)，勿過濃。6.8.3將玻片前后傾斜數(shù)次，以暗色背景襯底，在良好的照明條件下 進行觀察，陰性對照不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象都是陽性反應(yīng)。陽性反應(yīng)通常在3min內(nèi)發(fā)生。有時因血清效價低、反應(yīng)遲緩時，應(yīng)將玻片置培養(yǎng)皿 內(nèi)，并放一個濕棉球在旁邊，蓋上皿蓋，經(jīng)約20mi n,再觀察結(jié)果。如果仍然沒有出現(xiàn)凝聚，應(yīng)取斜面培養(yǎng)物，置含少量生理鹽水的試管 中，制成濃菌懸液，在100C水浴中保溫30min,以除去可能存在的Vi抗原，待冷，再做凝集試驗，如出現(xiàn)凝集，仍判為陽性反應(yīng)；如 不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則為陰性

14、反應(yīng)。6.8.4如對照試驗出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為非特異反應(yīng)，須對該菌株培養(yǎng)物進 行處理后再作凝集試驗。7結(jié)果判定7.1供試品培養(yǎng)物為革蘭陰性桿菌，三糖鐵瓊脂反應(yīng)及生化反應(yīng)符合 沙門菌屬反應(yīng)。多價1血清凝集試驗陽性反應(yīng)（含待檢培養(yǎng)物經(jīng)100C30min處理后凝集試驗為陽性反應(yīng)），報告10g或10ml供試品 檢出沙門菌。7.2供試品培養(yǎng)物三糖鐵瓊脂反應(yīng)或生化反應(yīng)不符合沙門菌屬反應(yīng)。多價1血清凝集試驗為陰性反應(yīng)（含待檢培養(yǎng)物經(jīng)100c30min處理 后凝集試驗為陰性反應(yīng)），報告10g或10ml供試品未檢出沙門菌。7.3供試品培養(yǎng)物出現(xiàn)下列情況，應(yīng)繼續(xù)鑒定或保留菌種，送交有關(guān) 單位進一不鑒定后，再作報告。73

15、1供試品培養(yǎng)物的生化反應(yīng)符合沙門菌屬反應(yīng)多價1血清凝集試驗陰性反應(yīng)。732供試品培養(yǎng)物的生化反應(yīng)不符合沙門菌屬反應(yīng)多價1血清凝集反應(yīng)呈陽性反應(yīng)。7.4對已檢出沙門菌的供試品分離的菌種， 有條件者，應(yīng)進一步作菌 型鑒定。根據(jù)檢出菌的特性， 推斷可能菌型， 增加生化試驗項目及沙 門菌單因子血清“O及“H進行鑒定。8注意事項8.1試驗用培養(yǎng)基，需經(jīng)過質(zhì)量鑒定，用已知典型反應(yīng)菌株（如乙型 副傷寒沙門菌CMCQB）50094進行測試，其靈敏度及特征性反應(yīng)應(yīng) 符合要求。培養(yǎng)基需在規(guī)定條件保存，在規(guī)定時間內(nèi)使用。分離平板 在使用 應(yīng)置36C溫箱內(nèi)倒置孵育12h,使其表面溫暖濕潤，利于 分離。8.2在對供試品

16、進行測試的同時，需做陽性菌對照及陰性對照。陰性 對照應(yīng)無菌生長，陽性對照應(yīng)顯示陽性結(jié)果，否則檢驗結(jié)果無效。特 別是用接種環(huán)沾取菌液進行接種或分離時， 避免動作過大，形成氣溶 膠，污染操作環(huán)境。8.3為保證試驗方法發(fā)可靠性，對分離平板上的疑似菌落，應(yīng)多選取 幾個菌落同時進行試驗。挑取菌落時，不要在分離平板菌落密集部位 挑取可疑菌落，而應(yīng)在菌落分布稀疏部位挑選。8.4生化試驗及血清學(xué)試驗的被鑒定培養(yǎng)物必須是純培養(yǎng)物，否則， 不可能得到正確結(jié)果。如遇血清學(xué)凝集試驗陽性而生化試驗不符合 時，應(yīng)首先檢查培養(yǎng)物的純度。對已污染的培養(yǎng)物，不應(yīng)丟棄，因為 污染菌可能掩蓋沙門菌，故應(yīng)對被污染的培養(yǎng)物重新分離，仔細選取 單個菌落再進行試驗。8.5所有生化反應(yīng)均需按照規(guī)定的試驗要求進行，如觀察三糖鐵瓊脂 斜面反應(yīng)的時間，應(yīng)在242h，時間過短過長，都可能出現(xiàn)錯誤的 結(jié)果判斷。又如氰化鉀