STR－PCR分析嵌合體在同種異基因造血干細(xì)胞移植中的應(yīng)用

1、STRPCR分析嵌合體在同種異基因造血干細(xì)胞移植中的應(yīng)用                作者：孫敬芬韓曉蘋趙丹丹汪菲菲靳海杰高春記達(dá)萬明于力【摘要】  利用熒光標(biāo)記的多重PCR擴(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)序列(STRPCR)結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測供者細(xì)胞嵌合率(DC),以探討該方法的連續(xù)檢測對異基因造血干細(xì)胞移植(alloHSCT)后轉(zhuǎn)歸的預(yù)警作用， 采集27例清髓性外周血干細(xì)胞移植患者移植前、移植后不同時段的外周血或骨髓，DNA樣本用Profiler Plus和

2、Cofiler Plus商品化試劑盒擴(kuò)增后,用ABI310遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳,確定基因位點及峰面積,根據(jù)基因型的差異選擇嵌合率計算公式。結(jié)果表明： 兩種試劑盒測得的DC嵌合率一致;在27對中能區(qū)別出供受差別的STR位點，Profiler Plus為6.3(4-9)個, Cofiler Plus為4.9(2-6)個。26例患者均在移植后28天出現(xiàn)供者細(xì)胞，1例患者未出現(xiàn)供者細(xì)胞。14例患者DC 100%,均獲得持久植入,至今仍無白血病生存；另有9例患者出現(xiàn)不穩(wěn)定混合嵌合(MC)狀態(tài)(DC為0%-90.2%),其中5例為血液學(xué)復(fù)發(fā)。27例病人中有6例死亡。上述5例復(fù)發(fā)患者均在出現(xiàn)臨床癥狀前發(fā)

3、生DC量下降;供者細(xì)胞完全嵌合組移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率高于MC組。結(jié)論：動態(tài)檢測DC可用于移植動力學(xué)研究,對移植物早期植入或被排斥、疾病復(fù)發(fā)以及GVHD的發(fā)生均有預(yù)警作用,對早期實施臨床干預(yù)治療有重要的指導(dǎo)意義。 【關(guān)鍵詞】  同種異基因造血干細(xì)胞移植； STRPCR; 毛細(xì)管電泳; 嵌合體Application of Chimerism Analysis to Allogeneic Hematopoietic Stem Cell  Transplantation by STRPCR   Abstract   The ai

4、m of this study was  to analyze chimerism,  evaluate the status of engraftment and predict the outcome of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT)  multiple short tandem repeat (STR) amplification using  fluorescence labeling polymerase chain reaction (PCR) c

5、ombined with capillary electrophoresis.   Peripheral blood and bone marrow in 27 patients who received myeloablative allogenetic cell transplantation  were collected before and after transplantation in different times. 10 and 7 different STR markers were coamplified in a single reacti

6、on by using a commercial AmpF/STR Profiler Plus/Cofiler plus PCR amplification kits. Separation of the PCR products and fluorescence detection were performed by ABI prism 310 Genetic Analyzer with capillary electrophoresis. The Genescan and Genotype soft ware were used for size calling and quantific

7、ation of peak areas. The formula to calculate donor chimerism values was based on the different allelic distribution type between donor and recipient. The results showed that donor chimerism was similar by the two methods. The median number of informative alleles was 6.3(4-9) by Profiler Plus and 4.

8、9(2-6) by Cofiler Plus. The donor alleles appeared in 26 patients on day 28 post transplantation. One patient was not observed to  appear donor alleles. 14 patients with 100% donor chimerism (DC) had stable engraftment and they still survive in free leukemia. 9 patients had unstable mixed chime

9、rism (DC: 0%-90.2%), and 5 of them relapsed after alloHSCT,  6 patients died. Decrease of donor chimerism appeared  prior to graft rejection and disease relapse. The incidence of GVHD was higher in  group of full donor chimerism. It is concluded that dynamic monitoring donor chimerism

10、 by  STRPCR in combination with all autocapillary electrophoresis   is a valuable tool for predicting graft rejection, disease relapse and occurrence of GVHD, and  provides a basis for early clinical intervention in the patients received alloHSCT.   Key words  

11、; allogeneic  hematopoietic stem cell transplantation; STRPCR; capillary electrophoresis; chimerism   J Exp Hematol 2007; 15(2):337-341   同種異基因造血干細(xì)胞移植(alloHSCT)是治療惡性血液病和免疫缺陷性疾病的有效手段之一,移植成功與否與供者細(xì)胞在受者體內(nèi)的植入情況,即嵌   合體的形成有關(guān)。供者細(xì)胞嵌合率(donor chimerism, DC)的下降與移植物排斥及本病復(fù)發(fā)密切相關(guān)

12、1,因此移植后動態(tài)檢測嵌合狀態(tài)對判斷移植效果、實施臨床早期干預(yù)治療尤為重要2。目前，嵌合體的監(jiān)測已成為同種異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后患者的常規(guī)檢測項目，檢測方法已由傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)方法發(fā)展到分子生物學(xué)方法，其中熒光標(biāo)記的多重PCR擴(kuò)增STR位點結(jié)合全自動毛細(xì)管電泳方法敏感性高,重復(fù)性好,簡單高效,已成為目前國際骨髓移植登記處(IBMTR)推薦的檢測供受嵌合狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)。我們用上述方法對27例alloSCT患者嵌合狀態(tài)進(jìn)行了連續(xù)動態(tài)檢測。   一般資料   27例病人為2005年10月-2006年7月在中國人民解放軍總醫(yī)院血液科及其附屬304醫(yī)院血液科接

13、受alloHSCT的患者,其中急性髓系白血病(AML)8例,急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL) 2例,慢性粒細(xì)胞白血病(CML)11例,急性非淋巴細(xì)胞白血病2例，再生障礙性貧血2例，類小細(xì)胞肺癌1例，骨髓增生異常綜合征1例。27例中接受同胞供者外周血干細(xì)胞移植者22例,接受無親緣關(guān)系供者外周血干細(xì)胞移植者5例。男22例,女5例,中位年齡33.7(13-46)歲。供受者性別相合19例,性別不合8例，20例同胞供者HLA均相合;2例為父母給子女HLA單倍相合供者；非親緣供者HLA相合4例,HLA不相合1例。   樣本采集   術(shù)前采集供者和受者外周血或骨髓,術(shù)后2

14、8天采集受者骨髓,術(shù)后3個月內(nèi)每月1次采集骨髓,此后每3個月1次采集受者骨髓，部分復(fù)發(fā)者每2周采集1次骨髓或外周血，肝素抗凝,4保存。   試劑和儀器    DNA抽提選用美國Promega公司DNA Purification kit試劑盒,PCR擴(kuò)增試劑盒為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI) AmpF/P STR Profiler plus和Cofiler Plus商品化試劑盒,選擇D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820  9個基因位點和1個性別位點及D3S

15、1358、D16S539、TH01、TPOX、CSF1PO、D7S820和1個性別位點所對應(yīng)的熒光標(biāo)記的特異性引物同時進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增,基因位點特異性同文獻(xiàn)3。內(nèi)標(biāo)Rox500及等位基因梯Ladder購自ABI公司,去離子甲烯胺購自Promega公司。主要儀器有ABI公司2400PCR擴(kuò)增儀和prism310遺傳分析儀,Amersham公司的GeneQuant pro紫外分光光度計。   DNA提取   采用Promega公司的DNA抽提試劑盒,按試劑盒說明程序進(jìn)行基因組DNA提取，用紫外分光光度計測定DNA濃度,調(diào)整DNA終濃度為2 ng/l。 

16、  DNA擴(kuò)增程序   參照文獻(xiàn)4 PCR總體積為50 l: 擴(kuò)增混合液20 l +引物混合液10 l +Taq酶5U/l +模板DNA 1 l (2 ng)。熱循環(huán)參數(shù)為: 預(yù)變性95 11分鐘, 94 1分鐘, 59 1分鐘, 72 1分鐘, 28個循環(huán),最后60延伸45分鐘。   全自動毛細(xì)管電泳   取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1.5 l或Ladder 1 l加入21 l上樣液(去離子甲烯胺20 l +Rox500內(nèi)標(biāo)1.0 l), 95變性5分鐘后立即冰浴至少5分鐘,ABI310遺傳分析儀采用POP4 (Perforance

17、Optimized Polymer 4)膠及36 cm長毛細(xì)管進(jìn)行全自動毛細(xì)管電泳及片段分析。   信息分析   遺傳分析儀應(yīng)用Genescan 3.1軟件,根據(jù)Rox500內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)確計算出DNA擴(kuò)增片段堿基長度,讀出峰下面積值，并應(yīng)用Genotype 2.1軟件,根據(jù)DNA片段長度及等位基因梯Ladder閱讀各位點的基因型。   計算嵌合率   根據(jù)供受者基因型的差異,選擇嵌合體計算公式5，代入峰下面積值,計算供者細(xì)胞嵌合百分率（DC）,供者細(xì)胞嵌合率取所有信息位點DC的均值。   統(tǒng)計學(xué)處理&

18、#160;  應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。   結(jié)   果   STR信息位點的選擇   我們選擇Profiler Plus的9個STR位點均為4個堿基串聯(lián)重復(fù)序列,加上1個性別位點,共10個位點。Cofiler Plus的6個STR位點也是4個堿基串聯(lián)重復(fù)序列,加上1個性別位點,共7個位點。27對供受者中能區(qū)分出彼此差別的平均STR位點數(shù)為Profiler Plus 6.3(4-9)個, Cofiler Plus有4.9(2-6)個,非親緣供者Profiler Plus為7.8 (7-

19、9)個, Cofiler Plus為5.5(5-6)個；在親緣供者中Profiler Plus為6.5(4-9)個，Cofiler Plus為4.4(2-6)個。            用兩種試劑盒擴(kuò)增STRPCR方法檢測DC嵌合率的結(jié)果比較   對11例移植患者同時應(yīng)用Profiler Plus和Cofiler Plus兩個試劑盒擴(kuò)增STRPCR進(jìn)行DC檢測,兩種擴(kuò)增試劑盒的結(jié)果具有較好的一致性。附圖顯示1例接受兩種試劑盒擴(kuò)增患者移植后6個不同時間點DC結(jié)果。 &

20、#160; 移植后28天嵌合體的檢測   27例患者在移植后28天的骨髓STRPCR嵌合體檢測結(jié)果顯示: 移植后28天完全嵌合(complete chi merism, CC)26例,混合嵌合(mixed chimerism, MC)1例。18例持續(xù)CC中,目前存活14例且仍保持完全緩解狀態(tài),死亡4例。死亡病人中1例在移植后280天死于間質(zhì)性肺炎,1例在移植后60天死于腦出血，1例在移植后120天死于肝衰竭，1例在3次輸注供者外周干細(xì)胞后，于120天時死于彌漫性血管內(nèi)凝血，但上述患者死亡時嵌合體仍為100%供者型嵌合。9例MC中1例在移植后28天死于沒有植入；8例分別在移植

21、后不同時間呈現(xiàn)MC和CC，其中1例在移植后60天轉(zhuǎn)為完全受者型后死亡。   MC患者的嵌合體動態(tài)監(jiān)測   結(jié)果見附表。從附表中可以看出，例1患者嵌合體的比例隨時間不斷下降,在移植后180天嵌合體比例為90.2%,考慮可能早期復(fù)發(fā)，遂住院治療，于210、270天查DC又下降，經(jīng)骨髓像檢測確為血液學(xué)復(fù)發(fā)，目前該患者在進(jìn)一步治療中。例6患者在移植后28天為100%供者型嵌合，但在60天時DC下降為51.4%,此時骨髓中原始細(xì)胞占5%，bcrabl融合基因陽性，為本病復(fù)發(fā)。隨著時間推移DC呈下降趨勢，在98天時給予供者淋巴細(xì)胞輸注，19天后嵌合體為47%，目前嵌

22、合體和融合基因仍在動態(tài)檢測中。病例2、5、8、9  CML病人各在移植后不同時間出現(xiàn)混合嵌合狀態(tài)，但通過臨床干預(yù)治療又恢復(fù)到完全嵌合，現(xiàn)繼續(xù)對這些病人保持動態(tài)檢測。例7在90天時出現(xiàn)血液學(xué)復(fù)發(fā)，120天時嵌合率繼續(xù)下降，但目前患者已放棄治療。例3患者嵌合體在移植后60天由原先的100%供者型轉(zhuǎn)變?yōu)?00%受者型嵌合，并在幾天后死于本病復(fù)發(fā)。例4患者在28天時即為受者型，沒有出現(xiàn)供者成分，在40天左右死于沒有植入。   移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生   27例患者中僅1例發(fā)生度急性GVHD，后又轉(zhuǎn)為慢性GVHD。在CC組中慢性GVHD的發(fā)生率

23、為44.4%，高于MC組(為22.2%),這證明了MC患者可能不會出現(xiàn)嚴(yán)重的急性GVHD或慢性GVHD，這與文獻(xiàn)報道一致6。   免疫抑制劑的調(diào)整對嵌合狀態(tài)及臨床轉(zhuǎn)歸的影響   5例CML慢性期患者在移植后不同時間出現(xiàn)過MC，其中例8患者為分子生物學(xué)復(fù)發(fā)，出現(xiàn)一過性MC，快速減少環(huán)孢菌素A(CsA)用量,1月后由MC轉(zhuǎn)為CC。其余4例CML慢性期患者接受同性別移植后出現(xiàn)血液學(xué)復(fù)發(fā)，RTPCR顯示bcrabl mRNA陽性,例2和例9患者也在快速減少環(huán)孢菌素A(CsA)用量或停用后，1月余由MC轉(zhuǎn)為CC，bcrabl mRNA轉(zhuǎn)為陰性,目前仍處于持續(xù)分子生

24、物學(xué)緩解狀態(tài)；另外2例患者仍持續(xù)為MC。   討   論   多年來,已有多種植入狀態(tài)分析方法應(yīng)用于臨床，如紅細(xì)胞血型系統(tǒng)、白細(xì)胞抗原系統(tǒng)以及細(xì)胞遺傳學(xué)的染色體分析等，但由于這些方法程度不同地存在著敏感性差，需要的樣本量大，費時長，操作復(fù)雜，同性別不能檢測等局限,目前已逐漸被DNA分析技術(shù)所取代。利用短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)結(jié)合PCR的方法被認(rèn)為是目前檢測移植嵌合狀態(tài)最靈敏的方法之一7。熒光標(biāo)記的STRPCR結(jié)合毛細(xì)管電泳與銀染法相比，無論從靈敏度、準(zhǔn)確性和所需摸板量等方面均具明顯優(yōu)勢，而且該方法不需提前篩選供受者間的信息位點，而是同時對移植后樣品、移植前樣品進(jìn)行PCR、電泳，同時進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，這就使嵌合體的檢測更加快速、準(zhǔn)確，同時也節(jié)省了大量的人力、物力8。本研究中我們將復(fù)合擴(kuò)增熒光標(biāo)記STRPCR結(jié)合全自動毛細(xì)管電泳方法成功地應(yīng)用于27例接受alloHSCT患者的術(shù)后隨訪,應(yīng)用該方法對所有患者均能找到彼此可區(qū)分的STR位點,Profiler Plus 為6.3(4-9)個, Cofiler Plus為4.9(2-6)個, 非親緣供者Profiler Plus為7.8 (7-9)個, Cofiler Plus為5.5(5-6)個；在親緣供者中Pro