質(zhì)量分析方法驗(yàn)證中檢出限和定量限測(cè)定方法探討_魯靜

1、Drug Standards of China 2012,Vol.13No.1中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)2012年第13卷第1期33作者簡(jiǎn)介:魯靜,主任藥師;研究方向:中藥及天然藥質(zhì)量控制。Tel E-mail :lujing 方法學(xué)研究質(zhì)量分析方法驗(yàn)證中檢出限和定量限測(cè)定方法探討魯靜1,付凌燕2,王旭3(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京100050;2.吉林省吉林市食品藥品檢驗(yàn)所,吉林132000; 3.國(guó)家藥典委員會(huì),北京100061摘要分析、比較了IUPAC ,ICH 及國(guó)內(nèi)其他分析檢測(cè)領(lǐng)域關(guān)于檢出限和定量限的概念和測(cè)定方法,試驗(yàn)比較了幾種測(cè)定方法的差異,可為中藥質(zhì)量分析方

2、法驗(yàn)證中檢出限和定量限的測(cè)定方法提供參考。關(guān)鍵詞:檢出限;定量限中圖分類號(hào):R921.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):10093656(20121333Discussion on the Detecting Methods for Limit of Detection and Limit of Quantification in Validation of Analytical MethodLu Jing 1,Fu Lingyan 2,Wang Xu 3(1.National Institutes for Food and Drug Control ,Beijing 100050;2.Jilin C

3、ity Institute for Drug Control ofJilin Province ,Jilin 132001;3.Pharmacopoeia Commission of the People s Republic of China ,Beijing 100061Abstract :The concepts and detecting methods for Limit of Detection and Limit of Quantification were discussed based on the analysis and comparison with IUPAC ,IC

4、H and the other related fields domestic.Several different detection methods were compared by the test experiments.The suggestions were put forward for the provision of the detecting methods.Key words :limit of detection ;limit of quantification中國(guó)藥典2005年版一部收載了“中藥質(zhì)量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”(以下簡(jiǎn)稱“指導(dǎo)原則”,在很大程度上規(guī)范了中藥分析

5、方法研究工作中方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容,為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化研究提供了保證。然而,該指導(dǎo)原則基本上是模擬化學(xué)藥品分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則制定的,對(duì)中藥質(zhì)量分析的適用性存在一定問(wèn)題,2010年版中國(guó)藥典尚未對(duì)相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行修訂。其中檢測(cè)限、定量限的測(cè)定方法主要采用信噪比法,與權(quán)威國(guó)際組織以及我國(guó)其它行業(yè)(如環(huán)境分析、地質(zhì)分析及水質(zhì)分析的通行方法或標(biāo)準(zhǔn)相比,有較大的差距。1檢測(cè)限(檢出限“指導(dǎo)原則”1對(duì)檢測(cè)限的定義為:“檢測(cè)限系指供試品中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量”。并規(guī)定了確定檢測(cè)限常用“直觀法”和“信噪比法”。不同文獻(xiàn)使用“檢測(cè)限”或“檢出限”表示這一概念,比較認(rèn)為“檢出限”似乎更適合。檢出限一般分

6、為儀器檢出限和方法檢出限。前者是指在特定的儀器條件下,能可靠檢出的最小信號(hào)所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物質(zhì)的最小量(或濃度;后者則是指一個(gè)給定的分析方法在特定條件下能以合理的置信水平檢測(cè)出被測(cè)物的最小量(或濃度2-3。1.1檢出限的概念國(guó)內(nèi)一些文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)中定義的“檢測(cè)限”基本表述為儀器檢出限的概念4-6。1975年,國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC 正式推行使用檢出限的概念及相應(yīng)估算方法。IUPAC 對(duì)檢出限定義為:“某特定方法在給定的置信度內(nèi)可從樣品中檢出待測(cè)物質(zhì)的最小濃度或量”。1998年,IUPAC 發(fā)表的分析術(shù)語(yǔ)綱要(IUPAC Compendium of Analysis Nomencla-tu

7、re 7中規(guī)定:檢出限以濃度(或質(zhì)量表示,是指由特定的分析步驟能夠合理地檢測(cè)出的最小分析信號(hào)x L 求得的最低濃度C L (或質(zhì)量q L ,并規(guī)定應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)以足夠多的測(cè)定次數(shù)求出,譬如20次。檢出限的公式表示為:C L =ks b /mC L 檢出限;m 標(biāo)準(zhǔn)曲線在低濃度范圍內(nèi)的斜率;s b 為空白標(biāo)準(zhǔn)偏差;k 置信因子,一般取2或3。ICH (1996年關(guān)于分析方法驗(yàn)證的指導(dǎo)原則中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)2012年第13卷第1期34Drug Standards of China 2012,Vol.13No.1中對(duì)檢出限的規(guī)定,除目測(cè)法和信噪比法測(cè)定方法外,還規(guī)定了基于響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率而定義的

8、檢出限8:DL =3.3S響應(yīng)值的偏差;S 標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率?？梢酝ㄟ^(guò)一系列方法得到,如測(cè)定數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差,或基于制備的被分析物在檢出限范圍內(nèi)的校準(zhǔn)曲線(見下述標(biāo)準(zhǔn)曲線估算法。1.2檢出限的測(cè)量方法按照ICH 關(guān)于分析方法驗(yàn)證的指導(dǎo)原則8,取決于使用的是非儀器方法或儀器方法,檢出限的測(cè)定或估算方法主要有3種3,7:1.2.1目測(cè)法主要用于非儀器方法檢出限的確定,如薄層色譜法鑒別或限度檢查方法中檢出限的測(cè)定?？刹捎靡阎獫舛鹊谋粶y(cè)物樣品,按測(cè)定方法操作,以目測(cè)可有效判斷的量或濃度作為檢出限。例如薄層色譜法檢查鹽酸巴馬汀的檢出限測(cè)定:取鹽酸巴馬汀對(duì)照品適量,加乙醇制成每1mL 含0.04mg 的溶液,

9、作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取1mL ,置10mL 量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,分別點(diǎn)樣1 9L (相當(dāng)于0.004,0.012,0.020,0.028,0.036g ;另取對(duì)照品儲(chǔ)備液點(diǎn)樣1L ,3L (相當(dāng)于0.04,0.12g ,展開、目測(cè)法檢視,最低檢出限為0.012g ,見圖1。 圖1目測(cè)法檢出限測(cè)定1 7為點(diǎn)樣量0.004g 0.12g ;8,9為檢測(cè)樣品1.2.2信噪比法適用于能顯示基線噪音的儀器分析方法,是通過(guò)已知低濃度的被測(cè)物的檢測(cè)信號(hào)與基線噪音比較,確定可被檢測(cè)出的最小量或濃度(一般將信噪比為31或21的量或濃度作為檢出限。信噪比法也是一種直觀測(cè)量的方法,主要用于儀器檢出限的測(cè)量和判斷

10、。1.2.3基于偏差和斜率的方法方法檢出限是表征分析方法的最主要的參數(shù)之一。分析方法的檢出限不僅與儀器噪音有關(guān),還取決于整個(gè)分析過(guò)程的誤差總和,與樣品性質(zhì)、基質(zhì)及預(yù)處理過(guò)程等都有關(guān)系?；谄畹臏y(cè)定方法可采用已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與空白樣品,或已知含量的樣品在低濃度范圍按照分析步驟進(jìn)行測(cè)量,通過(guò)分析相當(dāng)數(shù)量的樣品(文獻(xiàn)報(bào)道12 20份計(jì)算方法的檢出限,計(jì)算公式為:C L =k i s i c珔XC L 方法的檢出限;k i 置信因子,一般取2或3;s i 樣品測(cè)量讀數(shù)的偏差;c 樣品含量值;珚X樣品測(cè)量讀數(shù)平均值。前述的ICH 的測(cè)定方法是基于偏差和校準(zhǔn)曲線斜率的測(cè)定方法。1.2.4校正曲線估算法9-1

11、0上述基于偏差計(jì)算檢出限的方法是假定在不同濃度加標(biāo)測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差(或s o ,s i 是一個(gè)定值,理論上是不嚴(yán)密的。為此,IUPAC 和歐盟推薦使用標(biāo)準(zhǔn)校正曲線法估算檢出限。當(dāng)濃度或量接近于0,目標(biāo)分析物的響應(yīng)很小,測(cè)量十分困難,IUPAC 認(rèn)為可用標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距來(lái)估算檢出限,見圖2。圖2校正曲線估算法圖示如上圖,VBx 表示在橫坐標(biāo)上任意濃度點(diǎn)Xi (包括零濃度的不確定度。橫坐標(biāo)上任何一個(gè)濃度點(diǎn)的置信區(qū)間為:Xi VBx當(dāng)濃度為0,截距a 的不確定度為VB Y ,a 的置信上限為Yc ,零濃度(空白X 0的置信區(qū)間Xc =VBx ,(X =0,即空白上限;Y N 是與檢出限X N 相對(duì)應(yīng)的信

12、號(hào)值,Y N =a +2VB Y ,檢出限:X N =(Y N a bDrug Standards of China2012,Vol.13No.1中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)2012年第13卷第1期35a校準(zhǔn)曲線的截距;b校準(zhǔn)曲線的斜率實(shí)際測(cè)定可采用信噪比法粗略估算得到檢出限和定量限濃度;在估算的檢出限和定量限濃度范圍,制備校準(zhǔn)曲線,利用上述公式,根據(jù)特定校準(zhǔn)曲線的截距a,斜率b,剩余標(biāo)準(zhǔn)差S Y及隨機(jī)統(tǒng)計(jì)變量計(jì)算出空白上限Xc,檢出限X N,測(cè)定下限X B(定量限,以此反映在給定條件下分析方法達(dá)到的靈敏度水平與數(shù)據(jù)質(zhì)量。因上述計(jì)算比較繁瑣,已有用于檢出限計(jì)算的軟件,如MDL Estimator,可免費(fèi)下載使

13、用。例如紅花藥材摻偽染色樣品中4種水溶性色素檢出限的測(cè)定:色譜柱為Agilent TC-C18柱;流動(dòng)相為乙腈-20mmolL1醋酸銨,0 15min,乙腈5%15%;15 25min,乙腈15%45%。測(cè)定溶液的制備:分別取檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅試劑,分別制成每1mL含0.1mg的混合溶液;分別取紅花藥材提取液(紅花0.5g,加75%乙醇10mL,超聲提取15min2mL,精密加上述對(duì)照試劑混合溶液0.25,0.5,0.75,1.0,1.25mL,加70%乙醇稀釋至5mL。測(cè)定法:分別取各濃度的溶液,各進(jìn)樣5L,平行進(jìn)樣5次,測(cè)定峰面積值。數(shù)據(jù)處理:采用MDLEstimator軟件處

14、理,直接得到檢出限值(MDL;利用斜率、截距值,分別采用ICH計(jì)算公式、偏差計(jì)算公式計(jì)算,分別得到檢出限值,并進(jìn)行比較。3種方法得到的檢出限(gmL1比較見表1。表13種檢出限測(cè)定或估算方法的結(jié)果比較成分DL=3.3SC L=k i s ic珚X校準(zhǔn)曲線估算法(MDL Estimator檸檬黃0.01930.01840.0255莧菜紅0.00740.00730.0127胭脂紅0.00740.00870.0184赤蘚紅0.00150.00150.0035從結(jié)果可以看出,ICH法與偏差測(cè)定法的結(jié)果基本一致;較校準(zhǔn)曲線估算法約低一倍。有文獻(xiàn)2認(rèn)為檢出限相差兩倍以內(nèi)應(yīng)認(rèn)為是無(wú)顯著性差異。ICH 法的計(jì)

15、算相對(duì)簡(jiǎn)單的多,可以作為推薦方法使用。2定量限“檢出限”界定待測(cè)物質(zhì)的“有無(wú)”,而定量限(也稱測(cè)定下限界定定性、定量的區(qū)間,是指分析方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定的濃度或量。指導(dǎo)原則定義的定量限為:“供試品中被測(cè)成分能被定量測(cè)定的最低量,其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具一定準(zhǔn)確度和精密度。用于限量檢查的定量測(cè)定的分析方法應(yīng)確定定量限。常用信噪比法確定定量限。一般以信噪比為101時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定”。與檢出限的測(cè)定方法類似,ICH關(guān)于定量限的測(cè)定方法也包括目測(cè)法、信噪比法和基于偏差和斜率的方法。其中,信噪比法內(nèi)容與中國(guó)藥典規(guī)定的內(nèi)容相同。但在實(shí)際試驗(yàn)測(cè)定中,是取相當(dāng)于信噪比10:1的被測(cè)物濃度的溶液,重復(fù)進(jìn)樣不少

16、于6次,計(jì)算響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。根據(jù)具體測(cè)定方法的精密度要求,如薄層掃描法RSD%3%,或高效液相色譜/氣相色譜法2%,該濃度或量即為定量限?；谄詈托甭史椒ǖ挠?jì)算公式為:QL=10S響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差;S標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。通過(guò)特定校準(zhǔn)曲線估算定量限(測(cè)定下限的方法已如上述。在檢驗(yàn)工作中,當(dāng)樣品測(cè)定值低于測(cè)定下限,高于檢出限時(shí),按“定量限”出具報(bào)告,并給出定量限的量值。在痕量分析檢測(cè)工作中,對(duì)低于定量限的樣品,可考慮選擇其它靈敏度更高的檢測(cè)方法測(cè)定。3討論“檢出”是定性概念,“檢出限”是測(cè)量計(jì)算得出的特定的量值。檢出限除表征儀器或方法的靈明度外,在檢測(cè)結(jié)果的判斷方面也十分重要。在檢驗(yàn)檢測(cè)工作中,低于分析方法檢出限的測(cè)量值,按“未檢出”出具結(jié)論,并需要報(bào)告檢出限的量值。特別是在痕量分析中,如殘留物檢測(cè)。報(bào)告的檢出限,應(yīng)該是方法的檢出限,而不是簡(jiǎn)單的由儀器信噪比判斷的數(shù)值。因此,明確、規(guī)范檢出限和定量限的測(cè)量方法十分必要。參考文獻(xiàn)1中國(guó)藥典S2010年版一部2010附錄130-1312田強(qiáng)兵分析化學(xué)中檢出限和測(cè)定下限的探討J化學(xué)分析計(jì)量,2007,16(3:72-733冉敬,杜谷,楊樂(lè)山,等關(guān)于檢出限的定義及分類的探討J巖礦測(cè)試,2008(4,27(2:155-1574GB/T13966-1992分析儀器術(shù)語(yǔ)S5GB/T4470