用定量PCR從雜交陽性融合噬菌斑中分離候選插入片段

1、    用定量PCR從雜交陽性融合噬菌斑中 分離候選插入片段        【摘要】目的為了在cDNA文庫雜交篩選目的基因過程中，當復篩的雜交信號對應于1個多克隆融合噬菌斑時，能夠快速、準確地分離出特異克隆的插入片段。方法依據(jù)定量PCR擴增的原理，利用初始模板量的不同，通過兩次PCR反應，鑒定和分離出所需cDNA片段。結果利用這一方法，在-1，4-半乳糖苷轉移酶cDNA的“步移”復篩中，從一個雙克隆融合斑中，得到了特異性克隆的插入片段，經(jīng)測序證實為-1，4-半乳糖苷

2、轉移酶的5cDNA序列，長1.9kb，從而完成了全長cDNA的克隆，節(jié)省了進行再次復篩的時間和材料。結論該方法簡便、快捷，可以顯著地節(jié)省時間和實驗材料，在新基因克隆中有一定的實用價值。【關鍵詞】定量聚合酶鏈反應雜交篩選融合噬菌斑基因克隆Isolating candidate inserted fragment from positive fused phage clones using quantitative PCRFAN Yuxin, YU Long*, JIANG Ying, DAI Fangyan, CUI Yingyu,CHEN Chiyuan, DONG Changyu, ZHAO

3、 Shouyuan.*Institute of Genetics, Fudan University, Shanghai, 200433 P.R.China.E-mail:Longyu【Abstract】ObjectiveTo isolate quickly and exactly the specific inserted fragment from fused phage clones which were obtained from cDNA library by hybridization.MethodsAccording to the amplification principle

4、of quantitative polymerase chain reaction (PCR) and based on the difference of original template quantity, target cDNA fragment was isolated and identified by two PCRs.ResultsA positive clone with specific cDNA fragment of HumGT-H1 gene was obtained from a two-phage fused clone by using this method,

5、 and the inserted fragment was verified to be the 5cDNA sequence of HumGT-H1,1.9kb in length. So another hybridization screening is not necessary.ConclusionThe method presented is effective and rapid in gene cloning and can greatly save time and materials.【Key words】Quantitative polymerase chain rea

6、ctionHybridization screeningFused phage clonesGene cloning在基因克隆的過程中，常需進行雜交篩選1。這一方法在從數(shù)十萬個克隆中尋找所需的少數(shù)克隆是行之有效的。在進行了2輪或3輪雜交篩選后，一般可得到單個克隆。但在某些情況下，產(chǎn)生陽性雜交信號的噬菌斑與無關的噬菌斑發(fā)生融合而無法獲得單克隆時，通常需再進行一次復篩。限于同位素定期供應等條件的限制，有時不得不多用1030天的時間，才能獲得目的克隆的插入片段。為此，我們設想此時如能用定量PCR鑒定和分離出目的克隆的插入片段2，則可以有效節(jié)省時間和材料。我們在分離和克隆新基因-1，4-半乳糖苷轉移酶

7、(HumGT-H1)全長cDNA的過程中，運用了定量PCR擴增策略，從兩個克隆的融合噬菌斑中得到了所需步移克隆的插入片段，從而證實這一設想是可行的。1材料和方法1.1實驗材料本實驗室雜交篩選HumGT-H1全長cDNA過程中獲得的有陽性雜交信號的融合噬菌斑，它由兩個克隆的噬菌斑彼此融合形成。人睪丸cDNA分子庫購自Clontech公司。Taq DNA聚合酶購自Promega公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，其中依據(jù)HumGT-H1的EST序列設計的特異引物兩條：GTH1-A：5-ACTCTTGAATGTGGGCTATCT-AG-3和GTH1-B：5-CAAACCAGAAATCCA

8、C-TGTGATG-3；gt10載體上克隆位點兩側各1個引物：EF：5-AGCAGCCAGTCAACACTTACG-3和ER：5-GAGTTTGCATATCGCCTCCATC-3。1.2實驗方法3(1)分離噬菌體插入片段：融合噬菌斑稀釋液為模板，以EF、ER為引物，4種dNTP各200mol/L，引物各0.5mol/L，Tris.HCl 20mmol/L，KCl 50mmol/L，MgCl2 3mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5U，PCR反應體積為50l。反應條件為93預變性4分鐘，93變性1分鐘，60退火1分鐘，72延伸1分30秒，35個循環(huán)，最后72延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠

9、電泳鑒定，以低熔點瓊脂糖凝膠分離兩條條帶，EB染色后在長波紫外燈下切割DNA條帶，65恒溫槽上保溫10分鐘以熔化膠塊并滅活可能污染的DNA酶，4冰箱存放備用。(2)定量PCR鑒別候選插入片段：以含回收DNA片段的低熔點瓊脂糖凝膠液為模板，用特異引物進行擴增鑒別候選插入片段，退火溫度改為54，其它條件同前。在反應進行至5、10、15、20、25個循環(huán)時間點分別取出10l進行電泳檢測，首先出現(xiàn)512bp特異片段的DNA模板樣品即視為來自候選克隆的插入片段。(3)測序：用PCR循環(huán)測序法進行DNA手工測序，SequiTherm EXCELTM DNA測序試劑盒購自Epicentre Techonol

10、ogies公司，具體操作按試劑盒說明書進行。2結果用GTH1-A和GTH1-B引物從人睪丸cDNA分子庫中擴增的PCR產(chǎn)物為雜交探針雜交篩選人睪丸cDNA分子庫。經(jīng)兩次雜交篩選，得到若干陽性克隆，其中一強陽性雜交信號來自一個融合噬菌斑，仔細觀察發(fā)現(xiàn)該斑由兩個緊密相鄰噬菌斑融合而成，此時如對該噬菌斑再次進行復篩鑒定，則還需10天以上才能作出鑒定，因急于得到正確候選克隆的插入片段，我們試用了PCR方法來分離正確侯選克隆的插入片段。首先，用gt10載體兩臂上的引物(EF和ER)擴增這個融合噬菌斑的稀釋液，PCR產(chǎn)物顯示為兩條電泳帶，長度分別約為1.9kb(a)和0.6kb(b)。為確定哪一條電泳帶是

11、我們所需的插入片段，我們用特異PCR引物(GTH1-A和GTH1-B)分別擴增這兩個條帶，但兩個條帶都能擴增出我們所預期的512bp長度片段，推測這一現(xiàn)象可能與DNA分子在電場遷移中的相互攜帶有關，即長片段電泳帶中含有少量的短片段，短片段電泳帶中亦含有少量的長片段。為此，我們繼而采用了定量PCR的策略，在PCR進行至第5、10、15、20、25個循環(huán)時，分別取出10l反應產(chǎn)物進行電泳鑒定。以a為模板的反應在5個循環(huán)后可見有512bp特異片段出現(xiàn)，而以b為模板的反應則無可見條帶。由此鑒別出1.9kb的a條帶即是我們所需克隆的插入片段。后來對1.9kb片段的測序結果(測序結果未示出)證實，這一基于

12、定量PCR的推斷是正確的，該片段是我們所需的HumGT-H1 5cDNA序列，該基因已在GenBank登錄，注冊號為AF020920。然后在10個循環(huán)后，a反應特異條帶更加明顯而b反應也可見特異條帶出現(xiàn)；至20個循環(huán)后，兩反應產(chǎn)物量的差別已無法區(qū)別(1)。在第5、10、15、20、25個循環(huán)時b反應產(chǎn)物與a反應產(chǎn)物面積掃描(分析軟件：Smart View 3.0)比值分別為0、0.47、0.91、0.96、0.98。A：融合克隆示意；B：以gt10EF/ER為引物擴增融合克隆，產(chǎn)物電泳顯示為1.9kb(a)和0.6kb(b)兩條帶；C：以HumGT-H1特異引物GTH1-A/GTH1-B分別對

13、a、b兩帶進行定量PCRFig 1Electrophoresis photograph of quantitative PCRA:Shown fused phage clone;B:Amplification of fused clone withprimers gt10 EF/ER.C:Quantitative PCR of band a and b with HumGT-H1 specific primers GTH1-A/GTH1-B3討論本實驗的依據(jù)是，第1次PCR后，產(chǎn)物雖經(jīng)電泳分離，但由于分子攜帶現(xiàn)象，在同一電泳樣品含有兩個以上長度不同的DNA片段時，從凝膠上回收某一長度DNA片段

14、，該回收DNA片段中都不可避免地含有另一長度片段的很少量分子，其攜帶量的多少與總的DNA加樣量成正比。就我們這個實驗而言，即a帶中可能含有少量的b片段分子，b帶中可能含有少量的a片段分子。第2次PCR反應時，由于引物是特異的，因此對作為擴增模板的a片段或b片段而言，它們中只有一種長度的DNA片段是對應于特異引物的特異DNA模板，可以擴增出PCR產(chǎn)物。然而由于a、b兩個電泳條帶的彼此微量攜帶摻雜，盡管特異模板量在兩條電泳帶中相差懸殊，但在進行了常規(guī)的PCR循環(huán)擴增之后，二者所有產(chǎn)生的特異擴增產(chǎn)物量仍難以區(qū)分。以致不能判斷哪一條電泳帶是我們所需的特異目標片段。我們運用劑量PCR的原理，采用不同時點

15、采樣的方式，發(fā)現(xiàn)在僅進行了5個循環(huán)的擴增后，含特異模板量多的樣品就已能產(chǎn)生出較大量的特異擴增產(chǎn)物，而含特異模板量少的樣品則不能產(chǎn)生足以顯示的產(chǎn)物，由此而分辨出哪一條電泳帶的回收片段是對應于特異引物的特異模板。而當進行至15個以上的循環(huán)時，即使特異模板量少的樣品亦可產(chǎn)生足夠多的特異擴增產(chǎn)物而使其與另一個反應無法區(qū)別。由本實驗看出，定量PCR技術在基因克隆中也可發(fā)揮作用。當遇到雜交陽性克隆為融合噬菌斑時，此法與再次雜交篩選鑒定方法相比，具有簡便，快速等優(yōu)點。2比較了兩種方法的操作時間，定量PCR方法只需幾小時而雜交篩選需幾天，可見定量PCR可大大縮短實驗進程。如再考慮到我國同位素購買的時間限制因素

16、，本方法的優(yōu)勢則更加明顯。2定量PCR法與雜交篩選鑒定操作時間的比較Fig 2Time comparsion of two methods本實驗的鑒別對象是兩個克隆的融合噬菌斑，當復篩后的雜交陽性信號對應于3個以上克隆的融合噬菌斑時，則更能體現(xiàn)此方法的優(yōu)勢。但是，當融合噬菌斑中的幾個克隆中，正確克隆的插入片段和無關克隆的插入片段長度十分接近，用電泳難以分開時，則此方法難以奏效。盡管如此，我們認為定量PCR技術在基因克隆中仍不失為一種有用的輔助方法。本課題受國家863高技術項目資助作者單位：200433上海，復旦大學遺傳學研究所；余龍：通信聯(lián)系人參考文獻1施少林，余龍，吳國俊，等.人類“鋅指”蛋白基因ZNF191 cDNA的分離與克隆.自然科學進展，1997，7(4)499-502.2Horikoshi T, Danenberg K, Volkenandt M, et a