苦丁茶冬青葉多糖的提取及含量測(cè)定(1)

1、苦丁茶冬青葉多糖的提取及含量測(cè)定(1)    【關(guān)鍵詞】 苦丁茶冬青葉多糖；,提??；,苯酚摘要：目的研究苦丁茶冬青葉多糖含量的測(cè)定方法。方法以水提醇沉的方法從苦丁茶冬青葉中提取得到苦丁茶冬青葉多糖并以正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化顯色條件，采用苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖含量。結(jié)果測(cè)定波長(zhǎng)為482 nm，最佳顯色條件為6%苯酚用量1.0 ml，濃硫酸用量7.0 ml，反應(yīng)時(shí)間40 min。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A0.054 6C-0.003 3（n10），r0.999 8，并在2.5145.11 mgL1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。平均回收率為98.55，RSD1.86（n5）。測(cè)得多糖

2、平均含量為31.90，RSD1.75（n6）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可為其繼續(xù)研究開發(fā)及應(yīng)用提供參考依據(jù)。關(guān)鍵詞：苦丁茶冬青葉多糖； 提取； 苯酚硫酸法； 含量測(cè)定； 正交實(shí)驗(yàn)Extraction and Determination of the Polysaccharides from the Leaves of Ilex kudincha C. J. TsengAbstract：ObjectiveTo study the determination method for polysaccharides in the leaves of Ilex kudincha C. J. Ts

3、eng.MethodsThe leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng were defatted with 95% EtOH，extracted with water and precipitated with 80% EtOH, and then was deproteined three times by Sevag method, and from which, a crude polysaccharide noted as KPSwas obtained. The traditional colorimetric method applied for t

4、he determination of polysaccharides from the leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng was developed by the use of phenylhydrate-sulfuric acid, and was optimized by orthogonal experiment.Results The results showed that the wavelength for measurement was 482 nm. The best colorimetric conditions were the ti

5、me of reaction of 40 min and the dosage of 6% phenylhydrate and H2SO4 of 1.0 and 7.0 ml, respectively. Linear range was 2.5145.11 mgL1(A0.054 6C-0.003 3，r0.999 8). The average recovery was 98.55% and RSD was 1.86% (n5). The polysaccharide content of KPS was 31.90 and RSD was 1.75 (n6). ConclusionThe

6、 method used in this paper is simple, accurate and stable. The result obtained may act as a base for the further study and application of it.Key words：Polysaccharides from the leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng; Extraction； Phenylhydrate-sulfuric acid method； Determination； Orthogonal experiment &#

7、160;   苦丁茶冬青Ilex kudincha C. J. Tseng是冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬喬木植物，主產(chǎn)于湖南、湖北、廣東、廣西、海南等省。葉（苦丁茶）苦、甘、涼。清熱解毒，祛暑。主要用于治療頭痛、齒痛、目赤、熱病煩渴、痢疾等癥1。近年來，已有人對(duì)苦丁茶冬青葉（苦丁茶）的化學(xué)成分和藥理作用作了一些研究，為其臨床應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)2。迄今為止，對(duì)其具有生物活性的多糖成分研究未見報(bào)道。本文首次從苦丁茶冬青葉中分離提取得到粗多糖，并以正交設(shè)計(jì)L9（33）優(yōu)化顯色條件，研究了苯酚-硫酸法測(cè)定苦丁茶冬青葉多糖含量的方法，為其進(jìn)一步研究開發(fā)與

8、應(yīng)用提供了參考依據(jù)。1 儀器與材料1.1 原料苦丁茶冬青葉水提物精粉?？喽〔瓒嗳~由海南澄邁萬昌苦丁茶場(chǎng)提供，經(jīng)晾干、粉碎后，用水于80浸提，提取液經(jīng)濃縮后噴霧干燥得紅棕色粉末，密封保存?zhèn)溆谩?.2 儀器紫外可見吸收光譜儀（UV2501PC，日本島津公司）；真空干燥箱（8764S型，上海錦屏儀器儀表有限公司）；低速離心機(jī)（CL12，新專紅旗電機(jī)廠）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。1.3 試劑苯酚（AR，鄭州市德眾化學(xué)試劑廠），使用前重蒸餾；無水乙醇、無水乙醚、95乙醇、三氯甲烷、正丁醇、硫酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭褂们拔刺幚怼? 結(jié)果2.1 多糖的提取3,4稱取苦丁茶冬

9、青葉水提物噴霧干燥粉末10 g，加入95乙醇200 ml浸泡過夜，抽濾，取濾渣重復(fù)以上操作直至乙醇液無色時(shí)止。80 烘干，加入去離子水200 ml溶解，過濾除去不溶物質(zhì)。向?yàn)V液中加入95乙醇至含醇量達(dá)到80，邊加邊攪拌，得灰白色絮狀沉淀。靜置6 h后進(jìn)行離心分離沉淀，回收上層乙醇溶液，取固體部分再重復(fù)溶解、沉淀、離心分離操作至乙醇液澄清無色為止。溶解后，將體積比4 1的三氯甲烷/正丁醇混合液等體積加入多糖溶液中，振蕩30 min后，靜置，除去中間層變性蛋白質(zhì)，并收集上層清液，重復(fù)以上操作3次去除蛋白。加入4倍95%乙醇醇析，水溶后再醇析2次，固體部分用少量無水乙醇洗滌2次，再用無水乙醚洗滌2次

10、，自然晾干后放入真空干燥箱干燥4 h（50 ，0.096 MPa），得淺灰褐色固體，即為苦丁茶冬青葉粗多糖KPS。2.2 含量測(cè)定2.2.1 最大吸收波長(zhǎng)的選擇精密吸取352.0 mgL1苦丁茶冬青葉多糖KPS溶液1.0 ml置10 ml容量瓶中，加入6苯酚1.0 ml，混勻，再加入7.0 ml硫酸，混勻后室溫放置30 min，以蒸餾水補(bǔ)至刻度，混勻。以蒸餾水替代多糖溶液如上法配制空白，在600300 nm范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。結(jié)果見圖1。確定最大吸收波長(zhǎng)為482 nm。圖1 苦丁茶冬青葉多糖KPS顯色后紫外光譜圖（略）2.2.2 顯色條件的選擇以顯色劑6苯酚用量、硫酸用量和反應(yīng)時(shí)間作為考察因素，采用正交設(shè)計(jì)L9（33）優(yōu)選最佳顯色條件，因素與水平見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，并采用直觀分析法5對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，濃硫酸用量是影響顯色條件的最主要因素，顯色劑6苯酚用量的影響次之，而反應(yīng)時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響不大。最佳顯色條件為A2B2C3，即6%苯酚用量1.0 ml，濃硫酸用量7.0 ml，反應(yīng)時(shí)間40 min。表1 L9（33）正交設(shè)計(jì)水平（略）表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略） 2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取無水葡萄糖純品25.06 mg，定容于100 ml容量瓶中，分別吸取0，0.1，0.