神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3及其受體在小鼠脾的分布和基因表達(dá)

1、    神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3及其受體在小鼠脾的分布和基因表達(dá)        摘要目的在蛋白和基因水平進(jìn)行神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3 (NT-3) 及其高親和力受體 TrkC 的小鼠脾定位研究。 方法免疫組織化學(xué)和原位雜交。 結(jié)果脾內(nèi)存在 NT-3、 TrkC 免疫反應(yīng)陽性 (-ir) 細(xì)胞和 mRNA。 NT-3-ir 細(xì)胞屬于網(wǎng)狀細(xì)胞， 主要散布于動(dòng)脈周圍淋巴鞘 (PALS)、 淋巴小結(jié)和血管內(nèi)壁。 TrkC-ir 細(xì)胞則分布于邊緣區(qū)和紅髓， 細(xì)胞性質(zhì)有待確定。 原位雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)， NT-3

2、 mRNA 和 TrkC mRNA 分別與相應(yīng)的免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞有一致的分布。 免疫組化和原位雜交對(duì)照實(shí)驗(yàn)均為陰性。 結(jié)論NT-3 和 TrkC 能夠被脾內(nèi)不同的細(xì)胞合成， 提示 NT-3 有可能具有調(diào)節(jié)脾功能的作用。關(guān)鍵詞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素免疫組化原位雜交脾小鼠中號(hào) The Distribution and Gene Expression of Neurotrophin-3 inthe Spleen of MouseYang HongYang QingfengZhou ChangmanJu GongFan Ming(Institute of Basic Medical Sciences, Acade

3、my of Military Medical Science, Beijing 100850)Objective and Method The distribution of NT-3/TrkC immunoreactive (ir) cells and NT-3/TrkC mRNA in the spleen of BALB/c mice were studied using immunohistochemical and in situ hybridization methods. Results The result showed that both NT-3/TrkC-ir cells

4、 and mRNA were present in the spleen. NT-3-ir cells belonged to the stroma cells of spleen and scattered mainly in the periarterial lymphoid sheath (PALS), lymphatic follicles and the inner wall of the blood vessels. While TrkC-ir cells were found only in the marginal zone and red pulp, although the

5、 characteristic of TrkC-ir cells were remained to be identified. NT-3 mRNA and TrkC mRNA showed a very similar distribution pattern with their corresponding immunoreactive cells as revealed by in situ hybridization. The control experiment for both immunohistochemistry and in situ hybridization showe

6、d a negative staining. Conclusion The present study indicated that both NT-3 and TrkC could be synthesized by different cells of spleen, which suggested a possible regulation effect of NT-3 on the function of spleen.Key words neurotrophic factor；immunohistochemistry；in situ hybridization；spleen；mous

7、e近年來不斷積累起來的研究結(jié)果表明， 傳統(tǒng)概念上主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子也具有免疫調(diào)節(jié)作用。 這一發(fā)現(xiàn)為研究神經(jīng)-免疫兩大系統(tǒng)之間的相互調(diào)節(jié)開辟了新的領(lǐng)域。 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在免疫系統(tǒng)的合成和免疫細(xì)胞上神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體的表達(dá)， 是它們發(fā)揮功能作用的先決條件。 目前研究較清楚的是神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (NGF)。 已知 NGF 能夠在免疫器官合成， 而且免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞能夠表達(dá)功能性的 NGF 受體1，2。NT-3 是 NGF 家族的另一神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子， 對(duì)交感神經(jīng)元和神經(jīng)脊來源的感覺神經(jīng)元有著與 NGF 相似的促生長(zhǎng)發(fā)育和促存活作用。 NT-3 的生理作用是通過與酪氨酸激酶受體 TrkC 結(jié)合而實(shí)

8、現(xiàn)的。 近來有報(bào)道， NT-3 和 TrkC mRNA 存在于免疫器官3， 但其細(xì)胞定位和功能尚不清楚。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)和原位分子雜交方法， 在蛋白和基因水平研究 NT-3 和 TrkC 在小鼠脾的細(xì)胞定位，旨在為探討該因子的免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。1材料和方法免疫組織化學(xué)78 周的雄性 BALB/c 小鼠 6 只， 體重 2025 g。 20 g/L 異戊巴比妥鈉麻醉， 經(jīng)左心室灌注 4 的含 40 g/L 多聚甲醛、 0.01% (體積分?jǐn)?shù)) 戊二醛、 0.2% (體積分?jǐn)?shù)) 飽和苦味酸的磷酸緩沖液 (0.1 mol/L PB, pH7.4)。 10 min 后取出脾，

9、以不含戊二醛的上述固定液于 4 再固定 1216 h。 沿與脾長(zhǎng)軸垂直方向?qū)⑵⒎譃?4 等份， 取靠中線的一塊自脾門向脾背側(cè)做振動(dòng)切片， 片厚 30 m， 收集所有切片于 0.01 mol/L 的 PBS (pH7.4) 中。 常規(guī) ABC 法免疫組化染色， 硫酸鎳銨-DAB 法呈色。 特異性抗 NGF、 TrkC 多克隆抗體由美國(guó) Santa Cruz. 公司提供 (工作濃度 1500)。原位雜交1.2.1探針制備： 地高辛(DIG)標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒均為Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品。 人 NT-3 cDNA 探針的標(biāo)記采用PCR 法， 引物序列為 5-TCGGTACCGTA

10、CGCGGAGCAT 和 5-CCTCTAGATTATCATGTTCTTCCGA。大鼠TrkC(5-GAAGTGGCCGTTATGGTCTG GTTGGCT GTGCCCAGGGCAT TCTTAGCAAT-3)。TrkC 寡核苷酸探針由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器中心合成，以加尾法進(jìn)行DIG標(biāo)記。1.2.2標(biāo)本制備： 動(dòng)物處理和切片收集基本同免疫組化。 所不同的是， 灌注液中不加苦味酸和戊二醛， 冰凍切片厚度為 15 m， 貼于硅化的載片之上。1.2.3雜交反應(yīng)： 冰凍切片干燥后， 經(jīng) 5 mmol/L MgCl2-0.1 mol/L PBS (pH7.4) 沖洗， 1 mg/L 蛋白酶 K 37 消

11、化 20 min， 0.1 mol/L 甘氨酸-5 mmol/L MgCl2-0.1 mol/L PBS (pH7.4) 終止反應(yīng)， 40 g/L 多聚甲醛固定 20 min， 再用含 MgCl2 的 PBS 沖洗， 2×SSC 過渡， 梯度酒精脫水， 37 預(yù)雜交 1 h預(yù)雜交液： 50% (體積分?jǐn)?shù)) 去離子甲酰胺， 5×SSC， 5×Denhardt 液， 20 g/L SDS， 1 mg/L 變性鮭精 DNA， 42 雜交 1620 h (雜交液： 預(yù)雜交液加入 100 g/L 硫酸葡聚糖和相應(yīng)探針； DIG-NT-3 cDNA 探針濃度為 30 g/L，

12、 需變性； DIG-TrkC 寡核苷酸探針濃度為 1 mg/L， 無須變性， 同時(shí)還加入 100 mg/L polyA、 5 mg/L polydA)。 雜交后依次用含 50% (體積分?jǐn)?shù)) 去離子甲酰胺和 1 mmol/L EDTA 的 2×SSC， 37， 2×10 min、 1×SSC 55， 2×10 min、 0.5×SSC 55， 2×10 min 漂洗 (寡核苷酸探針的漂洗均在 37 下進(jìn)行并適當(dāng)縮短漂洗時(shí)間)， 繼之以緩沖液 1 室溫漂洗 2 min， 緩沖液 2 室溫孵育 30 min， 12500 標(biāo)記鹼性磷酸酶的

13、抗 DIG 抗體室溫 2 h， 經(jīng)緩沖液 1、 緩沖液 3 沖洗后， NBT/X-磷酸鹽 (4.5 L NBT+3.5 L X-磷酸鹽于 1 mL 緩沖液 3 中) 室溫閉光顯色 10 h， 1×TE 終止反應(yīng)， 脫水透明封片。2結(jié)果NT-3免疫組化結(jié)果顯示， NT-3 免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞主要存在于脾白髓， 屬于網(wǎng)狀細(xì)胞。 它們散在分布于動(dòng)脈周圍淋巴鞘 (PALS) 內(nèi)， 周邊較為密集 (1)。 陽性細(xì)胞大小不等、形態(tài)不規(guī)則， 大多數(shù)有形狀各異的胞漿突起 (3)。 在淋巴小結(jié)生發(fā)中心內(nèi)有少數(shù)陽性細(xì)胞， 它們分布稀疏， 有時(shí)甚至不可見 (1)。 圓或橢圓形， 無突起 (4)， 這類細(xì)胞的

14、性質(zhì)不明。 脾內(nèi)大、 小血管的內(nèi)皮細(xì)胞也部分呈現(xiàn) NT-3 免疫反應(yīng)陽性， 紅髓血管周圍還常見成群的陽性細(xì)胞。 白髓、 紅髓的淋巴細(xì)胞均呈免疫陰性反應(yīng) (1，3，4)。 原位雜交結(jié)果顯示， 與 NT-3-ir 細(xì)胞相似， NT-3 mRNA 主要分布于脾白髓 (2)， 于脾紅髓和血管內(nèi)皮也可見分布。1NT-3 免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞散在分布于小鼠脾白髓的動(dòng)脈周圍淋巴鞘和淋巴小結(jié)內(nèi)。 在淋巴小結(jié)生發(fā)中心內(nèi) (*) 有少數(shù)陽性細(xì)胞Fig 1NT-3 immunoreactive (ir) cells were scattered in the periarterial lymphoid sheath a

15、nd lymphoid follicle of spleen of mouse. Within the germinal center (*), NT-3-ir cells were sparse×1202分布于脾白髓 (WP) 的 NT-3 mRNAFig 2NT-3 mRNA were diffusely distributedin the white pulp (WP)×1203動(dòng)脈周圍淋巴鞘內(nèi) NT-3-ir 細(xì)胞的高倍鏡下所見Fig 3High magnification of NT-3-ir cells in the periarterial lymphoid

16、sheath×12004淋巴小結(jié)生發(fā)中心內(nèi) NT-3-ir 細(xì)胞的高倍鏡下所見Fig 4High magnification of NT-3-ir cells in the germinal center×1200TrkCTrkC-ir 細(xì)胞分布于邊緣區(qū)和紅髓， 圓或橢圓形， 無突起 (5) 性質(zhì)有待確定。 PALS 和淋巴小結(jié)內(nèi)的淋巴細(xì)胞呈免疫反應(yīng)陰性(5)。 在個(gè)別動(dòng)物， 白髓動(dòng)脈周圍淋巴鞘內(nèi)有彌漫的染色， 但著色非常淺且重復(fù)性不好。 原位雜交顯示， TrkC mRNA 分布于邊緣區(qū)和紅髓 (6)， 與免疫組化結(jié)果一致。5分布于邊緣區(qū)和紅髓的 TrkC-ir 細(xì)胞Fig

17、 5TrkC-ir cells in the marginal zone and red pulp of spleen×1206分布于邊緣區(qū)和紅髓的 TrkC mRNAFig 6TrkC mRNA in the marginal zone and red pulp of spleen×120對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫組化： 以 PBS 替代一抗和二抗均未見到陽性染色。 以正常兔血清替代一抗， 切片有極淺的非特異性著色。 原位雜交： 以不加探針的雜交液進(jìn)行雜交不能得到任何信號(hào)。3討論本實(shí)驗(yàn)在蛋白和基因水平均證實(shí)， NT-3 和 TrkC 存在于小鼠脾內(nèi)。 由于免疫組化和原位雜交的定位結(jié)

18、果非常吻合， 兩者可互為對(duì)照， 增加了結(jié)果的可信性。 NT-3 mRNA 和 TrkC mRNA 均較相應(yīng)的免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞密度大， 可能表明正常情況下， NT-3 和 TrkC 基因轉(zhuǎn)錄量大于蛋白翻譯量， 也可能與兩種方法的敏感性不同有關(guān)。 作者最近用脾非淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)上清孵育新生小鼠頸上神經(jīng)節(jié)， 證明了脾非淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生有活性的 NT-3， 從而佐證了本研究結(jié)果。PALS 內(nèi) NT-3-ir 細(xì)胞的形態(tài)與淋巴細(xì)胞完全不同， 為形狀不規(guī)則且?guī)в型黄鸬募?xì)胞， 屬于基質(zhì)細(xì)胞。 脾的基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成淋巴細(xì)胞發(fā)育、 成熟的微環(huán)境， 它們主要由來自于局部成纖維細(xì)胞的網(wǎng)狀細(xì)胞和來自于骨髓單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞構(gòu)

19、成， 后者在 PALS 中轉(zhuǎn)化為交錯(cuò)突細(xì)胞4。 網(wǎng)狀細(xì)胞均勻地散布于白髓， 與自身產(chǎn)生的網(wǎng)狀纖維一起構(gòu)成 PALS 內(nèi)微細(xì)的網(wǎng)架； 交錯(cuò)突細(xì)胞具有抗原呈遞能力， 數(shù)量較網(wǎng)狀細(xì)胞少， 周圍聚集著淋巴細(xì)胞4。 網(wǎng)狀細(xì)胞不僅構(gòu)成淋巴器官的基本框架， 還參與產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)， 后者所含的多種整合素 (integrins) 家族分子在免疫活性細(xì)胞之間、 淋巴細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用中起重要作用。 此外， 網(wǎng)狀細(xì)胞還是支持、 營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)， 有人觀察到網(wǎng)狀細(xì)胞以類似雪旺細(xì)胞的形式包裹神經(jīng)纖維5。 本實(shí)驗(yàn)中， PALS 中的 NT-3-ir 細(xì)胞在形態(tài)、 數(shù)量以及分布特點(diǎn)上

20、均接近于網(wǎng)狀細(xì)胞。 而生發(fā)中心內(nèi)的 NT-3-ir 細(xì)胞則具不同形態(tài)， 它們?yōu)閳A或橢圓形， 無突起， 類似于普通巨噬細(xì)胞。脾是受交感神經(jīng)支配的器官， 因而 NT-3 可能是脾交感神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能得以維持正常所必需的因子。 作者曾證實(shí)， 免疫應(yīng)答中脾神經(jīng)纖維的數(shù)量增加， 膨體和分枝都明顯增多， 提示免疫功能活躍時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)也可能增加6。 脾基質(zhì)細(xì)胞含有 NT-3 這一結(jié)果， 有助于解釋特殊功能狀態(tài)下脾內(nèi)神經(jīng)可塑性的發(fā)生機(jī)制。 因而， 通過作用于交感神經(jīng)， NT-3 可能間接起到免疫調(diào)節(jié)的作用， 因?yàn)槠⒔桓猩窠?jīng)的免疫調(diào)節(jié)功能是很明確的。 另外， TrkC 免疫反應(yīng)產(chǎn)物及其 mRNA 的檢出提示脾

21、內(nèi) NT-3 還可能具有直接的局部作用。 本實(shí)驗(yàn)中， TrkC 免疫反應(yīng)產(chǎn)物及 TrkC mRNA 分布于脾邊緣區(qū)和紅髓的淋巴和巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞， 故脾內(nèi)局部產(chǎn)生的 NT-3 有可能直接影響淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的功能。 近來 NGF 高親和力受體 TrkA mRNA 先后在人和大鼠單核細(xì)胞7、 活化的 CD4+ T 細(xì)胞株8、 大鼠腹腔肥大細(xì)胞9上被檢出， 并且得到證明能夠單獨(dú)介導(dǎo) (無須低親和力受體的存在) 淋巴細(xì)胞的功能改變。 雖然目前尚缺乏 TrkC 參與免疫功能調(diào)節(jié)的直接證據(jù)， 作者最近發(fā)現(xiàn) 脾內(nèi) TrkC mRNA 水平在機(jī)體生理狀態(tài)改變 (束縛應(yīng)激) 時(shí)發(fā)生明顯變化， 提示免疫器官內(nèi)的

22、 NT-3/TrkC 系統(tǒng)可能具有免疫調(diào)節(jié)功能。本實(shí)驗(yàn)中我們還觀察到 NT-3 在脾血管內(nèi)皮細(xì)胞有豐富的表達(dá)。 NT-3 與循環(huán)系統(tǒng)之間有何關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報(bào)道， 推測(cè)可能與血管周交感神經(jīng)的營(yíng)養(yǎng)作用有關(guān)。 這一問題還有待于進(jìn)一步研究。楊宏（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850）楊青峰（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850）趙彬（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850）周長(zhǎng)滿（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850）鞠躬（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850）范明（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850）參考文獻(xiàn)1Lev

23、i-Montalcini R, Skaper SD, Dal Toso R. Nerve growth factor: from neurotrophin to neurokine. TINS, 1996, 19(11): 514-5202Scully JL, Otten U. NGF: not just for neurons. Cell Biology International, 1995, 19(5): 459-4693Laurenzi MA, Barbany G, Timmusk T, et al. Expresssion of mRNA encoding neurotrophins and neurotrophin receptors in rat thymus, spleen tissue and immunocompetent cells. Eur J Biochem, 1994, 223(3): 733-7414Weiss L, Sakai H. The hematopoietic stroma. Am J Anat, 1984, 170(3): 447-4635Blue J, Weiss L. Vascular pathway in non-