白細胞彈性蛋白酶抑制劑篩選模型的建立及抑制劑F02ZA2554A的研究

1、白細胞彈性蛋白酶抑制劑篩選模型的建立及抑制劑F02ZA2554A的研究         08-03-20 11:52:00     編輯：studa20         作者：智慧 任曉 司書毅 穆棟 路新華 崔曉蘭 董悅生 張華 賀建功 【摘要】  利用人源的白細胞彈性蛋白酶建立了一種快速、微量、靈敏的高通量體外篩選方法。利用該模型從微生物菌種庫菌株的次生代謝產(chǎn)物中篩選得到一陽性真菌F

2、02ZA2554。該菌株發(fā)酵液經(jīng)有機溶劑提取、硅膠柱層析、及HPLC ODS反相柱層析等活性跟蹤下的分離純化，得到活性化合物F02ZA2554 A，該化合物對白細胞彈性蛋白酶有中等強度的抑制活性，其IC50為32.4mol/L。通過對該化合物的紫外、質(zhì)譜、核磁等理化分析，確定該化合物為蒽醌類化合物中的大黃素甲醚(physcion)，該化合物的抗炎活性屬首次報道。 【關(guān)鍵詞】  人白細胞彈性蛋白酶抑制劑 大黃素甲醚 抗炎作用    Studies on the high throughput screening assay for HLE inhibito

3、r      ABSTRACT  Using LpyroglutamylLprolylLvalinepNA as the substrate, a high throughput screening assay was developed for screening HLE inhibitors with high S/N ratios (>5) and Zfactors (>0.85). In screening for HLE inhibitors from metabolites of microorganisms,

4、 a compound named F02ZA2554A was isolated from fungal broth with IC50 of 32.4mol/L. The spectrum data (UV, IR, MS and NMR) showed that it is physcion, which is the ubiquitous component in many kinds of herbs. These results maybe revealed the mechanism of physcion on antiinflammation, which has never

5、 been reported before.    KEY WORDS  Human leukocyte elastase inhibitor;  Physcion;  Antiinflammation    人白細胞彈性蛋白酶(human leukocyte elastase，HLE)是人體中的一種蛋白水解酶，它直接作用于肺、肝臟、腎臟等結(jié)締組織中的彈性蛋白、膠原蛋白、蛋白多糖等胞外基質(zhì)。體內(nèi)彈性蛋白酶表達過多或活性過高均可導致嚴重的組織損傷，并造成或加重多種如肺氣腫、慢性支氣管炎、膿血癥、腎炎、類風濕

6、關(guān)節(jié)炎和某些皮膚癥等疾病14。因此，彈性蛋白酶抑制劑已經(jīng)成為治療上述疾病藥物的重要研發(fā)方向之一。另外由于彈性蛋白酶可以破壞膠原纖維及組織基底膜層，在腫瘤的形成和腫瘤轉(zhuǎn)移方面起關(guān)鍵作用，所以彈性蛋白酶已經(jīng)成為抗癌新藥的作用靶點5，6。    本研究利用顯色方法建立了一種高通量的人白細胞彈性蛋白酶抑制劑體外篩選模型，經(jīng)驗證該模型快速、靈敏、穩(wěn)定。為了尋找新的HLE抑制劑，利用該模型對微生物的次生代謝產(chǎn)物進行了高通量的藥物篩選， 并從一株真菌的發(fā)酵液中分離得到活性化合物F02ZA2554 A，經(jīng)結(jié)構(gòu)確定為大黃素甲醚(physcion)，該化合物的抗炎活性此前未見報道。本

7、文就模型的建立、陽性菌株的篩選、活性化合物的分離及生理活性進行闡述。    1  材料與方法    1.1  篩選用微生物的菌株    放線菌和真菌由本室微生物菌種庫提供，微生物的代謝產(chǎn)物經(jīng)溶媒提取作為篩選樣品。    1.2  試劑及儀器    人白細胞彈性蛋白酶(human leukocyte elastase，HLE)和多肽底物均購自Sigma公司；Victor2 1420多標記分析儀(美國PE公司)；Gene

8、sysTM 2紅外分光光度計(美國Nicolet公司)；質(zhì)譜(AutospecUltima)；核磁共振500MHz(Inova)。    1.3  HLE活性測定原理及方法    HLE活性測定原理與方法參考文獻7，并稍加改動。以化學標記的多肽nitroanilide為底物，利用水解后的產(chǎn)物nitroanilide在405nm有特定吸收，通過測定酶反應(yīng)前后光吸收A值的變化，確定HLE酶的活性。反應(yīng)式如下：    HLE       多肽

9、Valnitroanilide多肽+nitroanilide(405nm)    篩選的操作過程為：在96孔板中加入測試樣品，加HLE酶液100l，再加入2l的篩選樣品，用DMSO作為空白對照。使用Victor2 1420多標記分析儀在405nm波長處讀取每孔A值(樣品本底A)；加入底物100l，37保溫反應(yīng)120min后再次讀取每孔的A值，并計算抑制率。    抑制率(%)=A2-A1(對照)-A2-A1(樣品)A2-A1(對照)-A2-A1(空白)×100%    1.4  F02

10、ZA2554的培養(yǎng)    將菌株F02ZA2554斜面接種于種子培養(yǎng)基(淀粉2%，葡萄糖1%，黃豆餅粉0.2%，麥芽粉0.6%，酵母0.5%，CaCO3 0.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，NaCl 0.2%，pH7.0)，27搖瓶培養(yǎng)3d。按1%接種的量接種發(fā)酵培養(yǎng)基(淀粉1.0%，葡萄糖2%，黃豆餅粉1.3%，酵母粉0.4%，麥芽粉0.8%，NaCl 0.05%，CaCO3 0.15%，pH7.0)27振搖培養(yǎng)6d。    1.5  F02ZA2554A的分離純化    F0

11、2ZA2554發(fā)酵液1000ml于3000r/min離心15min，分別收集菌體與上清，菌體用1000ml丙酮提取后，蒸去丙酮，用1000ml乙酸乙酯抽提二次，乙酸乙酯層經(jīng)無水Na2SO4脫水，濃縮抽干后得到褐色物質(zhì)2.3g。取1g樣品，用少量甲醇溶解后，使用硅膠柱(2.5cm×25cm)層析進行分離純化，洗脫系統(tǒng)為氯仿甲醇，收集合并活性組分，濃縮抽干后得固體62mg。將該活性組分在制備型HPLC(Waters 996 PDA)ODS反相柱(Phenomenex 20mm×250mm，10m)進行單組分的制備(流動相為50%乙腈，流速6ml/min，檢測波長210nm)，得

12、到橙黃色物質(zhì)F02ZA2554A 7.8mg。    2  結(jié)果與討論    2.1  篩選模型的建立    利用96孔板，在底物終濃度為10mmol/ml的條件下，加入不同稀釋濃度的HLE，測定不同HLE的酶量與A值的關(guān)系。結(jié)果表明在酶量0.5×10-48×10-4U/ml范圍內(nèi)與A值之間均呈很好的線形關(guān)系(圖1)。 將模型篩選時每孔的酶量確定為4×10-4U/ml。以烏司他丁注射針劑的原粉作為陽性對照測定對HLE的抑制活性，評價模型的靈敏度和穩(wěn)定性。結(jié)果表明烏司他丁在該模型上表現(xiàn)出強抑制活性，并具有較好的量效關(guān)系(圖2)，其IC50為1.1mol/L，篩選模型的Z因子>0.85，信噪比(S/B)>5。    2.2  F02ZA2554A對HLE的抑制活性    取濃度梯度稀釋(1001mol/L)的F02ZA2554A對HLE