哮喘大鼠肺CD4_T細(xì)胞Notch1基因啟動(dòng)子甲基化的研究_

1、·論著·哮喘大鼠肺CD4+T 細(xì)胞Notch1基因啟動(dòng)子甲基化的研究丁濤郭雪君顧問李成業(yè)甘麗杏上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院呼吸科（上海200092）【摘要】目的研究支氣管哮喘模型大鼠肺CD4+T 細(xì)胞中的Notch1基因mRNA 表達(dá)水平、Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA 甲基化水平及其甲基化改變的位點(diǎn)。方法20只Wistar 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和哮喘組（每組10只），哮喘組用卵白蛋白（OVA ）致敏并激發(fā)的方法建立哮喘大鼠模型。免疫磁珠分離肺CD4+T 細(xì)胞并進(jìn)行純度鑒定。Real-time PCR 檢測(cè)肺CD4+T 細(xì)胞Notch1基因mRNA 表達(dá)水平，重亞硫酸鹽測(cè)序

2、檢測(cè)Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA 甲基化水平。結(jié)果哮喘組大鼠肺CD4+T細(xì)胞中Notch1基因mRNA 表達(dá)水平為對(duì)照組的（2. 254 0. 403）倍（P 0. 01）。哮喘組大鼠肺CD4+T 淋巴細(xì)胞Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA 10個(gè)位點(diǎn)整體甲基化水平低于對(duì)照組（0. 150 0. 108比0. 300 0. 667，P 001）。結(jié)論哮喘大鼠肺CD4+T 細(xì)胞Notch1基因DNA 低甲基化可能參與了Notch1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，增高了Notch1基因的表達(dá)量，從而參與了哮喘的發(fā)病?！娟P(guān)鍵詞】哮喘；T 細(xì)胞；Notch1；DNA 甲基化A Study on the Methylat

3、ion of Notch1Gene Promoter in CD4+T Cells Isolated from Asthmatic Rat Lung Tissue DING Tao ，GUO Xue-jun ，GU Wen ，LI Cheng-ye ，GAN Li-xingDepartment of RespiratoryMedicine ，Xinhua Hospital Affiliated to Medical School of Shanghai Jiaotong UniversityShanghai ，200092，ChinaCorresponding Author ：GUO Xue-

4、jun ，E-mail ：guoxjz yahoocomcn 【Abstract 】Objective To examine the expression of promoter CpG island methylation of Notch1gene and explore the variable sites for DNA methylation in lung CD4+T cells of asthmatic rat modelsMethodsAn ovalbumin （OVA ）sensitized-challenged asthmatic rat model was establi

5、shedTotal T cellswere isolated and CD4+T lymphocytes were purified using magnetic beadsTwenty Wistar rats were randomly divided into a control group and an asthma group （n =10in each group ）CD4+T cells were isolated by immunomagnetic beads and identified by flow cytometry （FCM ）Realtime PCR was empl

6、oyed to examine the mRNA expression of Notch1gene in lung CD4+T cells and the methylation level of Notch1gene was examined by methylation-specific PCRResultsThe mRNA expression of Notch1in lung CD4+T cellsof the asthma group was 2. 254 0. 403times as much as that of the control groupThe total methyl

7、ation level of asthma group was lower than that of the control group （0. 150 0. 108vs0. 300 0. 667，P 0. 01）ConclusionPromoter demethylation is one of the major mechanisms of Notch1gene up-regulationin pathogenesis of asthma【Key words 】Asthma ；T cells ；Notch1；DNA methylationNotch 信號(hào)通路由Notch 受體、配體及細(xì)胞內(nèi)

8、效應(yīng)分子CSL 為脊椎動(dòng)物中的CBF1、果蠅中的Su （H ）及線蟲中的Lag1各轉(zhuǎn)錄因子的縮寫蛋白組成。哺乳動(dòng)物有5種Notch 配體（Delta1、Delta3、Delta4、基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30971302）；上海市教育委員會(huì)科研創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：09ZZ114）通訊作者：郭雪君，E-mail ：guoxjzyahoocomcn jagged1及jagged2）和4種Notch 受體（Notch14）1。Notch 是一個(gè)單次跨膜受體蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化，例如胚胎發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育和淋巴細(xì)胞分化2。研究表明Notch 信號(hào)通路在T 細(xì)胞分化和發(fā)育的各個(gè)階段有重要作用。在T

9、 細(xì)胞早期分化過程中，Notch1基因干擾會(huì)完全阻斷T 細(xì)胞的發(fā)育并使得B 細(xì)胞異常分化3。Notch 的一個(gè)重要功能就是調(diào)節(jié)Th 細(xì)胞分化。Notch 是Th2細(xì)胞分化必不·644·中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志2011年9月第10卷第5期Chin J Respir Crit Care Med ，September 2011，Vol. 10，No. 5可少的，但同時(shí)也能影響Th1細(xì)胞分化。Tacchini-Cottier 等4研究證明，Th1細(xì)胞的分化依賴于Notch3，而對(duì)于Notch1則依賴甚少。Notch1對(duì)激活Th2細(xì)胞分化有著非常重要的影響5。本課題組在之前的工作中發(fā)現(xiàn)

10、，哮喘小鼠模型組T 淋巴細(xì)胞中Notchl mRNA 的表達(dá)顯著高于對(duì)照組6。本研究通過檢測(cè)哮喘組與對(duì)照組Notch1基因DNA 甲基化水平的差異，以進(jìn)一步探究DNA 甲基化在調(diào)控Notch 信號(hào)通路以及對(duì)T 淋巴細(xì)胞分化的重要作用，為闡明哮喘復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制尋找新的研究方向。材料與方法一、材料1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6 8周齡Wistar 雄性大鼠20只，體重160 180g ，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （滬）2003-0002，使用許可證號(hào)：SYXK （滬）2003-0031。2設(shè)備和試劑：402AI 型超聲霧化器（上

11、海魚躍醫(yī)療公司），ABI 7500realtime PCR 系統(tǒng)（美國ABI 公司），BIO-RAD Gel 凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad ），DNA 修飾試劑盒（Chemicon 公司），流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur ），卵白蛋白（OVA ）（美國Sigma 公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司），realtime PCR 試劑盒（寶生物公司），大鼠CD4磁珠（美天旎），大鼠淋巴細(xì)胞分離液（美國Sigma 公司），大鼠CD3、CD4及Isotype Control 流式抗體（eBioscience ），ELISA 試劑盒（美國Invitrogen ）。二、方法1哮喘大鼠模

12、型建立：采用隨機(jī)對(duì)照原則將20只大鼠分成哮喘組和對(duì)照組，每組各10只。哮喘組于第0d 和第7d 皮下和腹腔注射002%OVA 混懸液1mL 和百日咳菌苗0. 6mL （6 109U ），第15d 至28d 用2%OVA 鹽溶液持續(xù)超聲霧化吸入進(jìn)行激發(fā)，霧化動(dòng)力為5L /min。對(duì)照組用生理鹽水代替OVA 進(jìn)行皮下、腹腔注射和霧化吸入。哮喘組在霧化吸入階段表現(xiàn)為煩躁不安、呼吸急促、腹肌痙攣、大小便失禁。在最后一次霧化吸入后24h 處死大鼠，收集標(biāo)本。2大鼠氣道反應(yīng)性激發(fā)檢測(cè)：所有大鼠于最后一次激發(fā)后24h ，給予1%戊巴比妥鈉50mg /kg腹腔注射麻醉，保留自主呼吸。分別行頸外靜脈、氣管、食管

13、插管，氣管導(dǎo)管與呼吸速度描記儀相連，測(cè)定潮氣量和氣體流速。食管導(dǎo)管遠(yuǎn)端插入食管中部或下1/3處，以獲得最大負(fù)壓為止，遠(yuǎn)端連接壓力換能器，測(cè)量食管腔段內(nèi)壓以替代胸腔內(nèi)壓，經(jīng)過4導(dǎo)生物信號(hào)處理系統(tǒng)輸入計(jì)算機(jī)，將潮氣量、氣體流速和食管內(nèi)壓換算成氣道阻力（Re ）和肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性（Cdyn ）。待約15min 大鼠穩(wěn)定后，頸外靜脈推注氯化乙酰膽堿（300g /kg）激發(fā)氣管，計(jì)算給藥后Re 、Cdyn 與基礎(chǔ)的Re 、Cdyn 比值。3細(xì)胞因子的檢測(cè)：大鼠血清收集：大鼠肺功能測(cè)定后，心臟穿刺采血約4mL ，置于促凝管中，室溫放置30min ，4000r /min離心10min ，吸取血清分裝后20 保存

14、。大鼠BALF 收集：充分暴露氣管及肺臟，在環(huán)狀軟骨氣管處剪一“V ”型切口，將靜脈留置針插入氣管至氣管隆突處，用7mL 預(yù)冷PBS液灌洗肺組織，共4次，回收BALF 約25mL ，1000r /min離心BALF 10min ，取上清液分裝后置于80 保存。血清、BALF 中IL-4、IFN-及血清總IgE 濃度測(cè)定：均按照美國Invitrogen 公司測(cè)定IL4、IFN-及IgE ELISA 試劑盒操作步驟進(jìn)行。4肺組織病理切片的制備：取大鼠左肺下葉，用10%福爾馬林緩沖溶液浸泡，固定24h 后常規(guī)制成5m 石蠟組織切片，HE 染色后觀察肺組織病理變化。5大鼠肺CD4+T 細(xì)胞分離：取兩組

15、大鼠剩余肺組織用含膠原酶和DNA 酶的消化液進(jìn)行消化后過200目篩網(wǎng)。所得細(xì)胞用1. 083g /mLFicol 淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，然后用大鼠CD4磁珠上Vario MACS 分選器進(jìn)行分選，分選后的細(xì)胞上流式細(xì)胞儀進(jìn)行純度鑒定。用臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞的活力。將分離后的細(xì)胞部分加Trizol 保存于80 進(jìn)行總RNA 抽提，部分用于全基因組DNA 的提取。6CD4+T 細(xì)胞DNA 的提?。悍谓M織CD4+T 的DNA 提取采用天根公司血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒，提取后測(cè)D 260值，計(jì)算DNA 濃度，所得基因組DNA 20 保存。7定量PCR 檢測(cè)肺CD4+T 細(xì)胞mRN

16、A 表達(dá)量：收集細(xì)胞加入Trizol 后進(jìn)行總RNA 抽提后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)細(xì)胞中Notch1基因mRNA 表達(dá)量。PCR 反應(yīng)體系為20L ，包括SYBR Premix Ex Taq 10L ，上下游引物各0. 4L ，ROX Reference Dye 0. 4L ，cDNA 模板2. 0L ，dH 2O 6. 8L 。PCR 反應(yīng)過程：步驟1：預(yù)變性，循環(huán)數(shù)1，95 30s ；步驟2：PCR 反應(yīng)，循環(huán)數(shù)40，95 5s ，60 34s ；步驟3：熔解曲線。以GAPDH 為內(nèi)參照基因，使用相對(duì)定量2Ct的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。設(shè)目的基因在對(duì)照組中的表達(dá)水平為1

17、，定量PCR 得到相應(yīng)Ct 值后用2Ct計(jì)算實(shí)驗(yàn)組目·744·中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志2011年9月第10卷第5期Chin J Respir Crit Care Med ，September 2011，Vol. 10，No. 5的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)，公式中Ct =（Ct 目的基因Ct 管家基因）實(shí)驗(yàn)組（Ct 目的基因Ct 管家基因）對(duì)照組。引物見表1。表1引物序列和產(chǎn)物長度基因名引物序列產(chǎn)物長度Notch1-RT上游5' ：TTTAGAAACAGGCCAAGACCTTGAA 114bp下游5' ：AGCCCATGCGGTGGTTACA GAPDH

18、 上游5' ：GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG 143bp下游5' ：ATGGTGGTGAAGACGCCAGTABSP 上游5' ：TGTGAATGGGGTTGTATATTTG 336bp下游5' ：AACAACAAATCCCCTCAAAA8基因組DNA 亞硫酸氫鹽修飾：基因組DNA 的亞硫酸氫鈉修飾采用基因組DNA 修飾試劑盒（Chemicon 公司）。修飾步驟按試劑盒說明進(jìn)行操作。9Notch1基因啟動(dòng)子甲基化亞硫酸氫鹽測(cè)序（BSP ）：根據(jù)GenBank 中公布的Notch1基因的全基因序列，根據(jù)Genomatix 預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列并應(yīng)用Meth

19、yl Primer Express Software v1. 0軟件分析，設(shè)計(jì)BSP （Bisulphite Sequencing ，重亞硫酸鹽測(cè)序）引物，引物范圍包括第一個(gè)外顯子第一個(gè)堿基上游224bp 和下游112bp 共336bp 長度，包括10個(gè)CpG 位點(diǎn)（引物序列見表1），第一個(gè)外顯子第一個(gè)堿基上游定義為，下游定義為+。反應(yīng)體系：Ex Taq Hot Start 酶預(yù)混液9L ，Ex Taq Hot Start 酶0. 3L ，甲基化（或非甲基化）正反引物各1L ，模板DNA 5L ，補(bǔ)足ddH 2O 至50L 。反應(yīng)條件：95 預(yù)變性15min 。95 變性30s ，58 退火3

20、0s ，72 延伸30s ，共40個(gè)循環(huán)，最后72 延伸7min 。瓊脂糖膠電泳：取最終BSP 反應(yīng)液各10L ，2%瓊脂糖膠電泳（90V ，40min ），Gel-Red （染色劑）染色，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照。割膠純化回收電泳DNA 產(chǎn)物，連接pGEMT 載體，轉(zhuǎn)化DH5a 感受態(tài)細(xì)菌，涂LB 固體培養(yǎng)基板，經(jīng)藍(lán)白篩選，每個(gè)板隨機(jī)標(biāo)本挑取1個(gè)陽性克隆培養(yǎng)，取2mL 菌液抽提質(zhì)粒，抽提產(chǎn)物送上海華大基因公司測(cè)序。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以SPSS 13. 0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用珋x s 表示，組間比較使用成組t 檢驗(yàn)和方差分析，BSP 組間比較采用Fisher 精確概率法進(jìn)行檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)P =0.

21、 05。結(jié)果一、大鼠肺功能測(cè)定記錄吸入氯化乙酰膽堿（Mch ）前后的Re 及Cdyn ，以吸入Mch 前后大鼠Re 或Cdyn 的比值來表示的氣道阻力和肺順應(yīng)性變化情況。兩組大鼠Re 較吸入Mch 前的基礎(chǔ)值均有一定程度的增加，而Cdyn 較吸入Mch 前均有一定程度降低。與對(duì)照組相比，哮喘組Re 實(shí)測(cè)值/基礎(chǔ)值顯著升高（P 0. 05），Cdyn 實(shí)測(cè)值/基礎(chǔ)值比值顯著降低（P 0. 05）。結(jié)果見表2。表2使用Mch 前后Re 及Cdyn 比值變化（n =10，珋x s ）組別實(shí)測(cè)值/基礎(chǔ)值Re Cdyn 對(duì)照組0976 01351022 0129哮喘組1393 0151*0805 007

22、5*注：與對(duì)照組比較，*P 005二、BALF 和血清中細(xì)胞因子檢測(cè)與對(duì)照組比較，哮喘組血清中IL-4及總IgE 均顯著升高（P 0. 01），而IFN-水平降低（P 0. 05）。與對(duì)照組比較，哮喘組BALF 中IL-4水平均顯著升高（P 0. 01），而IFN-水平顯著降低（P 0. 01）。結(jié)果見表3。三、大鼠肺組織HE 染色兩組大鼠肺組織病理切片比較發(fā)現(xiàn)，哮喘組支氣管黏膜存在不同程度的炎性改變，包括氣道上皮的破壞，氣道壁增厚，管壁黏膜下及管壁周圍炎性細(xì)胞浸潤，氣道平滑肌增生和痙攣。結(jié)果見圖1。四、CD4+T 淋巴細(xì)胞分離純度的鑒定流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示，分離的CD4+T 淋巴細(xì)胞純度9

23、5%。結(jié)果見圖2。表3大鼠血清及BALF 中細(xì)胞因子含量（n =10，pg /mL，珋x s ）組別血清IL-4IFN-IgEBALFIL-4IFN-對(duì)照組3942 1625077 198208952 274106544 39813674 396哮喘組5435 1764010 435*145830 1534710020 36310252 412注：與對(duì)照組比較，*P 005，P 001·844·中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志2011年9月第10卷第5期Chin J Respir Crit Care Med ，September 2011，Vol. 10，No. 5 五、定量PCR

24、檢測(cè)肺CD4+T 細(xì)胞中Notch1基因mRNA 的表達(dá)Notch1基因mRNA 在兩組肺CD4+T 細(xì)胞中都有表達(dá)。定量分析顯示，哮喘組肺CD4+T 細(xì)胞Notch1mRNA 表達(dá)量為對(duì)照組的（2. 254 0. 403）倍（P 0. 01）。結(jié)果見圖3 。與對(duì)照組比較，*P 001圖3肺CD4+T 細(xì)胞Notch1基因mRNA 的表達(dá)六、BSP 測(cè)序結(jié)果10個(gè)正常對(duì)照組和哮喘組測(cè)序標(biāo)本分別作統(tǒng)計(jì)（圖4和5），其中7和6兩個(gè)位點(diǎn)甲基化程度哮喘組明顯低于正常對(duì)照組（7位點(diǎn)甲基化率對(duì)照組為40%，哮喘組為0，P 0. 01；6位點(diǎn)甲基化率對(duì)照組為30%，哮喘組為0，P 0. 05）。其余8個(gè)位點(diǎn)

25、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。而10個(gè)位點(diǎn)整體甲基化水平哮喘組明顯低于對(duì)照組（0. 150 0. 108比0. 300 0. 667，P 0. 01，圖6） 。討論支氣管哮喘是一種多基因遺傳的復(fù)雜性狀疾·944·中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志2011年9月第10卷第5期Chin J Respir Crit Care Med ，September 2011，Vol. 10，No. 5病，以T 細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)致敏原的免疫反應(yīng)是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵性始動(dòng)環(huán)節(jié)。CD4+T 淋巴細(xì)胞在哮喘的發(fā)病中起著重要的作用，哮喘時(shí)存在Th1/Th2失衡，Th2免疫應(yīng)答增強(qiáng)。T 細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中存在諸多調(diào)控因子，例

26、如活化T 細(xì)胞核因子（NFAT ）、核因子B （NF-B ）和轉(zhuǎn)錄因子Tbx21、GATA3等。近年來研究表明，Notch 信號(hào)位于上述諸多調(diào)控因子（NFAT 、NF-B 、Tbx21、GATA3）信號(hào)傳導(dǎo)的上游7-9，調(diào)控T 細(xì)胞發(fā)育分化10。Notch 是一種單次跨膜受體蛋白，Notch 信號(hào)通路由Notch 受體、配體、細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子以及Notch 的調(diào)節(jié)分子等組成。Notch 受體主要位于T 細(xì)胞、B 細(xì)胞等，而Notch 配體則主要位于抗原遞呈細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞）。Notch 受體與配體結(jié)合后，Notch 受體釋放部分胞外片段，胞內(nèi)部分經(jīng)-促分泌酶（-secretase ）酶切后釋放

27、可溶性的Notch 胞內(nèi)段（NICD ）。NICD 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄抑制因子CSL 結(jié)合后即成為轉(zhuǎn)錄活化因子，最終影響細(xì)胞的分化、增殖和凋亡。我們前期的研究表明，Notch1信號(hào)是促進(jìn)哮喘Th1/Th2平衡向Th2傾斜的重要因素，哮喘小鼠肺組織T 細(xì)胞Notch1mRNA 和蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯升高6，哮喘小鼠模型分離的肺T 細(xì)胞Delta1較對(duì)照組明顯降低，Jagged1較對(duì)照組明顯升高。用Notch1特異的siRNA 阻斷Notch1信號(hào)，可使初始T 細(xì)胞由Th0向Th1方向分化11。支氣管哮喘中較多基因存在甲基化和去甲基化現(xiàn)象，包括IL-4、IFN-等12，但仍缺乏Notch1基因

28、的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠肺部CD4+T 細(xì)胞Notch1基因存在甲基化，其中7、6兩個(gè)位點(diǎn)甲基化率明顯高于哮喘組，即哮喘組此兩個(gè)位點(diǎn)去甲基化水平明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且哮喘組10個(gè)位點(diǎn)的整體甲基化率明顯低于對(duì)照組（0. 150 0. 108比0. 300 0. 667，P 0. 01）。CpG 位點(diǎn)的總體甲基化水平和特異CpG 位點(diǎn)的甲基化水平，哪個(gè)對(duì)基因表達(dá)具有更高的重要性，尚存爭(zhēng)議。本項(xiàng)研究中哮喘組的10個(gè)CpG 位點(diǎn)整體甲基化水平同樣低于對(duì)照組。最近有人用dnmt1/（DNA methyltransferase1，DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶1）小鼠證明，甲基化是T

29、 淋巴細(xì)胞分化的重要因素13。也許特異性位點(diǎn)的去甲基化有利于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，從而激活基因轉(zhuǎn)錄，Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)去甲基化可能促進(jìn)Notch1基因表達(dá)，從而使Th1/Th2免疫應(yīng)答向Th2偏移，導(dǎo)致哮喘發(fā)病。但本實(shí)驗(yàn)樣本量較少，有待今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步明確支氣管哮喘Notch1基因去甲基化位點(diǎn)與初始T 細(xì)胞由Th0向Th1方向分化，從而導(dǎo)致哮喘發(fā)病的關(guān)系。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步明確了Notch1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化位點(diǎn)，為進(jìn)一步建立哮喘中Notch1基因CpG 島甲基化圖譜奠定了基礎(chǔ)，對(duì)確定Notch1甲基化水平以及甲基化位點(diǎn)，從而找到治療哮喘新的靶點(diǎn)具有重要意義。參考文獻(xiàn)1Bray

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