在馬來(lái)西亞用300億OBmL小菜蛾

1、在馬來(lái)西亞用300億OB/mL小菜蛾顆粒體病毒防治小菜蛾的效果中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所生物農(nóng)藥中試基地 周英杰、邢帥軍整理K. W. Pow，技術(shù)服務(wù)與發(fā)展部，馬來(lái)西亞Farmcochem Sdn. Bhd.2008年8月至10月前言小菜蛾（Plutella xylostella）是十字花科蔬菜上危害最為嚴(yán)重的害蟲，其為害造成蔬菜品質(zhì)和產(chǎn)量的嚴(yán)重?fù)p失。小菜蛾的4個(gè)齡期都能危害，主要在十字花科蔬菜葉下部取食，留下干而脆的葉上皮，受雨滴的沖擊形成孔洞。受害葉片繼續(xù)生長(zhǎng)，孔洞合并或撕扯成片。不加選擇地應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥防治，導(dǎo)致不斷有高抗藥性的報(bào)道。這種狀況產(chǎn)生了尋求替代方法防治小菜蛾的需求。生物防治的手段已

2、經(jīng)有很多報(bào)道，其中包括使用Bt和病毒。NPV屬于桿狀病毒科，可以侵染400多種昆蟲，大部分是鱗翅目昆蟲。NPV有兩種表型，即SNPV（單粒包埋型NPV）和MNPV（多粒包埋型NPV）。有趣的是，SNPV在除鱗翅目外還有5個(gè)目的昆蟲中有報(bào)道，而MNPV只在鱗翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)。在人類已知的許多病毒中，還有一種特別的顆粒體病毒，即小菜蛾顆粒體病毒（GV），可以用來(lái)防治小菜蛾。病毒可以同其它防治手段相容，同化學(xué)農(nóng)藥相比不存在安全和/或健康的問(wèn)題，持效期長(zhǎng)，害蟲不會(huì)發(fā)展抗性，所以是非常適宜的防治手段。病毒以包含體（OB）的形式存在，在特定昆蟲中腸堿性環(huán)境下被激活，對(duì)非目標(biāo)昆蟲（如蜜蜂或者目標(biāo)害蟲的捕食性天

3、敵）等幾乎沒有影響。一旦病毒粒子進(jìn)入中腸上皮細(xì)胞，核衣殼即遷入細(xì)胞核，這種遷入可能同細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白有關(guān)。當(dāng)核衣殼接近細(xì)胞核后，其DNA脫去衣殼蛋白并進(jìn)入細(xì)胞核，的磷酸化導(dǎo)致病毒DNA解旋，表達(dá)并復(fù)制病毒基因組。這一過(guò)程與顆粒體病毒（GV）的有少許區(qū)別。GV的DNA是通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核的。對(duì)MNPV（苜蓿銀紋夜蛾NPV）來(lái)說(shuō)，病毒的一些核衣殼可能繞過(guò)細(xì)胞核，直接從細(xì)胞以出芽的方式出來(lái)，這樣可以比在中腸細(xì)胞復(fù)制基因組的病毒更快地侵染其它細(xì)胞。圖1 NPV在宿主昆蟲細(xì)胞中侵染復(fù)制示意圖病毒可以侵染敏感宿主所有主要組織的細(xì)胞，其過(guò)程是開始侵染中腸上皮細(xì)胞，然后擴(kuò)散到幾乎所有其它組織，并在其中產(chǎn)生包埋型

4、病毒。最終，宿主細(xì)胞破裂，釋放出病毒包含體或者出芽型病毒，出芽型病毒再侵染其它細(xì)胞和組織。雖然第一個(gè)在美國(guó)登記的桿狀病毒殺蟲劑（商標(biāo)是Elcar，1975年）商業(yè)化失敗了，但是1984年用核型多角體病毒防治黃杉毒蛾是個(gè)著名的桿狀病毒防治害蟲成功的例子。這一事件導(dǎo)致上世紀(jì)九十年代，人們加強(qiáng)了桿狀病毒分子生物學(xué)的研究，并且重新激起了工業(yè)化開發(fā)桿狀病毒殺蟲劑的興趣。田間應(yīng)用桿狀病毒的進(jìn)展主要是在過(guò)去的二十年內(nèi)獲得的。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展使大規(guī)模生產(chǎn)桿狀病毒控制害蟲的應(yīng)用成為了可能。本試驗(yàn)是為了測(cè)定一種來(lái)自中國(guó)的GV（300億OB/mL小菜蛾顆粒體病毒）在卡梅隆高地控制甘藍(lán)田里發(fā)生的小菜蛾的生物活性。方

5、法田間試驗(yàn)試驗(yàn)田屬生產(chǎn)卷心菜的農(nóng)場(chǎng)，位于卡梅隆高地Bertam村的大路邊，面積公頃。已經(jīng)定植40天左右，大部分植株已經(jīng)卷心。選擇該地塊是因?yàn)樾〔硕臧l(fā)生嚴(yán)重，化學(xué)農(nóng)藥不能控制其為害。小菜蛾種群已超過(guò)經(jīng)濟(jì)閾值，并且田間有大量的成蟲。卷心菜植株種植在高于地面的田圃上，沒有遮光，行間距是40cm×45cm。每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)有25株卷心菜。試驗(yàn)一共有100株，設(shè)置2個(gè)處理2個(gè)重復(fù)，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。在每塊試驗(yàn)地內(nèi)，所有的卷心菜按下述的處理列表處理，同時(shí)另外調(diào)查15株卷心菜作為處理間的隔離。除非下大雨，施藥和調(diào)查將每周都進(jìn)行。處理列表UTC未處理的對(duì)照GV9升水中加18毫升藥劑（PxGV），處理大約12

6、0株卷心菜。試驗(yàn)藥劑是一種GV，每毫升產(chǎn)品含有300億OB。用量相當(dāng)于每公頃用900毫升產(chǎn)品，噴水量是450升（稀釋500倍）。用背負(fù)式噴霧器噴灑藥液，配備3/64空心圓錐噴嘴。藥液直接噴灑在初展的第5-8片葉片的背部和菜頭的頂部。噴藥的日期分別是2008年8月4、12、15、24日，調(diào)查分別在2008年8月的3、5、12、15日進(jìn)行。調(diào)查記錄4個(gè)齡期中每個(gè)齡期的個(gè)體數(shù)，以及植株上所有的活蟲數(shù)。室內(nèi)試驗(yàn)室內(nèi)試驗(yàn)是為了研究GV侵染小菜蛾幼蟲后癥狀的發(fā)展及其致病性。沒有用化學(xué)農(nóng)藥處理的新鮮葉片采自上述卷心菜田。葉片洗凈，用下述方法處理，風(fēng)干后接入小菜蛾幼蟲。用手提式噴壺（mister）將藥液噴灑到

7、葉片上。UTC未處理對(duì)照（水）GV每升含有0.5毫升NPV（300億OB/毫升 PxGV，2000倍）從未處理田塊共采18頭幼蟲，一組是1齡、3齡、4齡各3頭，用GV處理的卷心菜葉喂養(yǎng)，另一組同樣的9頭試蟲用未處理卷心菜葉喂養(yǎng)。帶試蟲的葉子放在開口的塑料廣口瓶中，室溫12小時(shí)黑暗、12小時(shí)光照下培養(yǎng)。72小時(shí)后，所有活著的試蟲轉(zhuǎn)到未處理的葉片上，使其繼續(xù)取食。葉片每3天更換，保證試蟲的食物新鮮。如有蟲尸，即進(jìn)行檢查、除去并記錄。結(jié)果和討論室外試驗(yàn)試驗(yàn)是在2008年10月的雨季開始的。在Bertam村有中到大雨。處理前調(diào)查后（2008-8-3）第二天的早晨，進(jìn)行第一次噴灑GV試驗(yàn)（2008-8-

8、4），噴藥后3小時(shí)下了中到大雨，幾乎下了一整天。第二天（2008-8-5）進(jìn)行調(diào)查后立即重復(fù)補(bǔ)做試驗(yàn)。2008年8月3日和5日調(diào)查的結(jié)果沒有顯著差異。由于GV作用方式的原因，這一結(jié)果容易理解，與GV既不是內(nèi)吸性藥劑，也沒有觸殺作用的性質(zhì)相符合的。施藥后3小時(shí)的大雨把NPV沖刷掉了。隨后的幾天，天氣轉(zhuǎn)好，第二次噴灑GV（2008-8-5）的效果可以從9月12日的調(diào)查中看出。總體來(lái)說(shuō)，所有數(shù)據(jù)顯示，小菜蛾幼蟲對(duì)作物的為害以及活蟲的數(shù)量同對(duì)照相比都顯著降低了。同樣，2008年8月15日和24日調(diào)查的結(jié)果表明，與對(duì)照相比，活蟲數(shù)和為害情況都顯著降低。由于卷心菜臨近收獲，試驗(yàn)的結(jié)論從最后一次調(diào)查（200

9、8-8-24）得出。試驗(yàn)結(jié)果清楚地表明，GV處理后，活蟲數(shù)下降，作物的受害減輕。用GV作的對(duì)照只有未處理對(duì)照的大約50%，可能是因?yàn)檫@個(gè)試驗(yàn)開始時(shí)，小菜蛾幼蟲數(shù)量太大，并且各齡期混合發(fā)生。這一試驗(yàn)開始時(shí)，田間有大量的成蟲和繭（蛹），這樣可能給田間提供蟲源，增加了統(tǒng)計(jì)的幼蟲數(shù)。換一種說(shuō)法，對(duì)一種感染GV的特定害蟲，GV不大可能提供100%的防治。試驗(yàn)地塊沒有發(fā)現(xiàn)1齡和2齡的蟲尸，這樣死亡率的計(jì)算更傾向于推測(cè)性的。然而，3齡和4齡的蟲尸可以在GV處理的田塊中看到。蟲尸外觀黑色，一碰即破。低齡試蟲蟲體太小，其蟲尸可能被雨水打破。由于這個(gè)原因，死蟲數(shù)沒有被計(jì)入調(diào)查結(jié)果中。表1 用300億OB/mL P

10、xGV田間多次防治小菜蛾的效果（其中的數(shù)字表示平均受害的植株和15株卷心菜上不同齡期小菜蛾幼蟲的平均數(shù)）300億OB/ml小菜蛾顆粒體病毒懸浮劑多次防治小菜蛾效果工作時(shí)間對(duì)照試驗(yàn)病毒防治試驗(yàn)染蟲卷心菜數(shù)量1齡2齡3齡4齡總計(jì)染蟲卷心菜數(shù)量1齡2齡3齡4齡總計(jì)1-Sep2-SepA3-Sep129925133725T4-SepA&T無(wú)差別 5-Sep125551025105874246-Sep7-Sep8-Sep9-Sep差別 10-Sep11-SepA&T12-Sep136561330932551513-Sep14-SepA&T15-Sep123558218243413

11、16-Sep差別 17-Sep18-Sep19-Sep20-Sep21-Sep22-Sep23-SepA24-Sep11547824712341025-Sep26-Sep差別 27-Sep28-Sep29-Sep30-SepA=評(píng)價(jià)T=防治室內(nèi)試驗(yàn)室內(nèi)試驗(yàn)中，所有幼蟲放到葉片上幾分鐘即取食活躍。幾乎所有GV處理葉片上的幼蟲在開始的12到24小時(shí)內(nèi)停止取食。而未處理葉片上的幼蟲持續(xù)取食、蛻皮，并產(chǎn)生大量糞便。由于處理葉片上幼蟲停止取食，蟲體塌成扁平形狀，隨著時(shí)間推移，逐漸變褐、變黑。每次調(diào)查的蟲尸數(shù)列入下表。表2 室內(nèi)300億OB/mL PxGV防治小菜蛾的效果（數(shù)字表示當(dāng)日葉片上的死蟲數(shù)）防治

12、蟲齡12HAT24HAT48HAT3DAT5DAT7DAT10DAT14DAT對(duì)照試驗(yàn)100010000300001000400000000GV防治112-30111-401-11-與田間試驗(yàn)相對(duì)照，取食GV處理葉片的所有齡期的幼蟲死亡率都是100%。有1齡和3齡幼蟲各一頭，分別在第3天和第5天死亡。然而，其蟲尸僵硬，觸碰不化水，推測(cè)這兩個(gè)幼蟲可能死于其它不明的原因。所有GV感染的1齡幼蟲都在24小時(shí)內(nèi)死亡。身體變黑，蟲尸一碰即破。這一結(jié)果解釋了田間試驗(yàn)NPV處理后，1齡幼蟲較少，看不到其蟲尸的現(xiàn)象。1齡幼蟲可能被雨水打破并沖到地下。NPV處理的3齡幼蟲早期前部顯示壞死癥狀，并逐漸延伸到后部。這些壞死的體節(jié)外觀黑褐色。并且觸碰后蟲尸破裂并化水。有大量的液體從破裂的死亡組織中冒出。上面的照片顯示3齡幼蟲取食噴灑300億OB/mL GV的葉片被感染的情況（紅色箭頭指示取食NPV后8-12小時(shí)，蟲體前部壞死癥狀和18到24小時(shí)蟲體后部壞死癥狀）。值得注意的是，2頭4齡幼蟲試圖結(jié)繭并化蛹了。蛹體從外面清楚看見，顏色比正常蛹黑，我們及時(shí)進(jìn)行了微型解剖，以確定繭中的試蟲是否存活。這兩個(gè)蛹是死的，碰了以后化水了。致謝試驗(yàn)中使用的300億