基于復合納米材料-離子液體的新型乙酰膽堿酯酶生物傳感器的研制并用于有機磷農(nóng)藥的檢測1

1、基于復合納米材料-離子液體的新型乙酰膽堿酯酶生物傳感器的研制并用于有機磷農(nóng)藥的檢測的綜述1 引言目前食品安全是全社會廣泛關注的焦點問題。近幾年，雖然國內外不斷加大對食品安全監(jiān)管的力度，但“從農(nóng)田到餐桌”的食品產(chǎn)業(yè)鏈條依然危機四伏，不斷通過各種媒體進入公眾視野的如“瘦肉精”豬肉中毒事件、“劣質奶粉事件”、“蘇丹紅事件”、“多寶魚”、“二噁英”、“農(nóng)藥殘留”等事件，使民眾對食品安全憂心忡忡。 在原料農(nóng)、牧產(chǎn)品的生產(chǎn)中，大量不合理的使用獸藥、化肥、激素，使農(nóng)業(yè)及農(nóng)村環(huán)境污染日益加劇，大量有毒有害物質附著沉淀在農(nóng)（畜）產(chǎn)品中，如水果、蔬菜中的有機磷、有機氯農(nóng)藥的殘留，在草莓、番茄、香蕉、西瓜等農(nóng)產(chǎn)品中

2、使用催熟劑，糧食作物中鉛、鎘等重金屬污染，豬肉中瘦肉精、禁用獸藥等的殘留都會引起慢性、急性食物中毒，食品安全從原料開始，便受到嚴重的威脅。在水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)中，不法業(yè)主為了提高水產(chǎn)品的成活率和出品率，不惜使用禁用魚藥，甚至使用激素類藥物，有些藥物代謝速度非常慢，因此大量殘留在成品中，嚴重威脅著人民群眾的身體健康。在食品安全檢測中，農(nóng)藥殘留量已經(jīng)成為重要的檢測指標。農(nóng)藥殘留檢測技術和標準是保證食品安全的重要支撐。時代的發(fā)展對食品農(nóng)藥殘留檢測的靈敏度要求越來越高，檢測范圍也在擴大。農(nóng)藥殘留檢測不僅要檢測農(nóng)藥的目標物，還要對其毒性比較大的代謝物進行檢測。這無疑對食品農(nóng)藥殘留的檢測提出了更高的要求?，F(xiàn)在常

3、用的檢測手段有色譜法、色譜-質譜聯(lián)用法和波譜法1,2，這些方法雖然選擇性和靈敏度較好，但儀器復雜、價格昂貴、操作繁瑣、使用成本高、難以在現(xiàn)場使用，因而普及困難。因此，迫切需要研究和開發(fā)一些快速、方便、可靠的食品安全檢測技術。生物傳感器分析技術與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在線檢測等優(yōu)點，它作為一種檢測手段已在食品安全檢測領域得到廣泛的研究與應用。生物傳感器3的應用大大縮短了農(nóng)藥殘留的檢測所用的時間， 而且基于電化學方法的生物傳感器， 為儀器的小型化、智能化提供了可能。電化學生物傳感器的原理如圖1所示，其構成包括兩部分：生物敏感膜和換能器。被分析物擴散進入固定

4、化生物敏感膜層，經(jīng)分子識別，發(fā)生生物學反應，產(chǎn)生的信息繼而被相應的化學換能器或物理換能器轉變成可定量和可處理的電信號，再經(jīng)二次儀表（檢測放大器）放大并輸出，便可知道待測物濃度4,5。圖1：電化學生物傳感器示意圖電化學生物傳感器根據(jù)生物分子識別元件上的敏感物質可分為酶傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器、DNA 傳感器及組織傳感器等。而基于酶的電化學生物傳感器主要有電壓型6、電流型7和電壓電流型三類。所用的酶類主要有水解酶、膽堿氧化酶、乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶等，進而形成了單酶型 (膽堿酯酶或水解酶)和雙酶型 (膽堿酯酶與膽堿氧化酶)的電化學生物傳感器。近年來，基于特定酶活性的抑制原理設計的酶生物

5、傳感器(EBS)在農(nóng)藥殘留的檢測方面受到極大的關注，例如乙酰膽堿酯酶生物傳感器在農(nóng)藥殘留方面的檢測。乙酰膽堿酯酶(AChE，也稱真膽堿酯酶)，廣泛存在于動物的組織、血液、昆蟲組織及植物中。早在30多年前，就有AChE提取方法的報道。由于昆蟲飼養(yǎng)容易且繁殖周期短，因此昆蟲的乙酰膽堿酯酶8,9的提取倍受青睞。多以昆蟲幼蟲為材料分離純化乙酰膽堿酯酶。目前，主要有兩種提取乙酰膽堿酯酶的方法：一種是硫酸銨和丙酮沉淀法；另一種是凝膠過濾層析法(Sephadex G-100和G-200兩種)?，F(xiàn)在市場上使用的酶主要是從敏感家蠅頭部提取純化的乙酰膽堿酯酶10,11 。膽堿酯酶電流型傳感器的工作原理12,13：

6、底物氯化乙酰硫代膽堿酯酶在催化作用下水解為乙酸和巰基膽堿，巰基膽堿是具有電活性的物質，在外加一定電勢的前提下，可在pt、玻璃等基礎電極表面氧化，產(chǎn)生的氧化電流強度可反映出它的電極表面的濃度。當膽堿酯酶被農(nóng)藥抑制時，氧化電流的大小能準確的反映出酶被抑制的程度，從而檢測出農(nóng)藥殘留的濃度。CH3-CO-O(CH3)2-NCl(CH3)3CH3-COOH+HO-(CH2)2- NCl(CH3)3 (1) Enz-Ser-OH+R-O-PO-(OCH3)2Enz-Ser- O-PO-(OCH3)2+R-OH (2) 水解檢測氯化硫代乙酰膽堿水解電流并按下式計算AChE的百分抑制率：A=(I0-I)/I0

7、 ×100A：酶的百分抑制率（與農(nóng)藥殘留具有正相關性）I0：未被有機磷抑制的酶電極穩(wěn)定響應電流（空白電流）I：指被有機磷抑制后酶電極的穩(wěn)態(tài)響應電流2 國內外研究進展2.1 乙酰膽堿酯酶的固定化2.1.1 吸附法吸附法是通過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互作用而達到固定目的的方法。只需將酶液與具有活潑表面的吸附劑接觸，再經(jīng)洗滌除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最簡單的固定化技術，在經(jīng)濟上也最具有吸引力。該方法操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價易得，而且可反復使用。但酶與載體結合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制14。吸附法分為物理吸附法和離子吸附法。物理吸附法常用

8、的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。離子吸附法常用的交換劑有CM-纖維素、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等；其他離子交換劑還有各種合成的樹脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。Takeshi Shimomura等15研制了雜交介孔膜固定酶檢測乙酰膽堿的電流型生物傳感器。AChE和膽堿氧化酶固定于孔隙直徑為12nm的雜交介孔二氧化硅膜上。測量連續(xù)的酶反應產(chǎn)生的過氧化氫，檢測范圍為 6.0800M，反應時間約3 min。與自由酶相比穩(wěn)定性好，在保存80天后還有80%酶活性。還研究了通過對AChE的抑制檢測Ops殺蟲劑。Zheny

9、u Wang等16研究了通過不同的納米粒子吸附和抑制AChE。在有蛋白質和酶的情況下，通過反應會引起人造納米粒子的中毒。AChE是存在于大腦、血液和神經(jīng)系統(tǒng)中主要的酶，因此，通過SiO2，TiO2，Al2O3，Al，Cu，CuC，MWCNT和SWCNT八種納米粒子吸附和抑制AChE。修飾埃爾曼試驗測定AChE活性，因為納米粒子能吸附顏色變化的微黃色產(chǎn)物，5-巰基-2-對硝基苯甲酸 (5-MNBA)。通過AChE活性的減少評價納米粒子的吸附和抑制速率。SWCNT對AChE的吸附可達94%，納米SiO2和Al2O3吸附最低。然而，有Cu和CuC納米粒子釋放的Cu2+ 能使AChE的活性分別減少40

10、%和45%。通過這些試驗AChE用于納米粒子的生物標記有很大的潛力。2.1.2 共價結合法共價結合（偶聯(lián)）法是目前研究中最活躍的方法。它的原理是酶蛋白分子上的功能基團和固相支持物表面上的反應基團之間形成共價鍵，因而將酶固定在支持物上。共價偶聯(lián)法得到的固定化酶結合牢固、穩(wěn)定性好、利于連續(xù)使用。但是載體活化的操作復雜，反應條件激烈，需要嚴格控制條件才可以獲得較高活力的固定化酶。共價鍵結合法所采用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。Ivaylo Marinov 等17將聚合丙烯腈膜和金納米粒子（GNPs）制成膜孔固定AChE，用1-甲基-3-碳亞胺

11、氫氯化物通過共價鍵的方法固定酶到納米管薄膜上。最佳固定條件為：酶溶液；4 C下固定15h，同時檢測了固定酶的生物化學特性和動力學參數(shù)。Wei Zhu等18報道了一種新的微透析-電化學裝置同時檢測用N-甲基-（R）-豬毛菜酚處理的鼠腦中的乙酰膽堿和膽堿，研制了聚合物（m-(1,3)-苯二胺）（pmPD）和聚酪胺固定酶的電化學生物傳感器。這種生物傳感器的應用能更好的理解帕金森疾病的發(fā)病機理。Ravi Sinha 等19研制了基于氧化鋅溶膠-凝膠的AChE生物傳感器用于殺蟲劑的檢測。研究了用氧化鋅做基質固定AChE的電流型生物傳感器檢測殺蟲劑對氧磷，對氧磷在，可以通過對AChE的抑制檢測有機磷殺蟲劑

12、。固定的酶的活性在，4 C下能保持三個月。Subramanian Viswanathan 等20報道了聚苯胺沉積到ssDNA包埋垂直組裝的碳納米管修飾AChE電化學生物傳感器用于檢測殺蟲劑。 通過殺蟲劑對酶的抑制分別檢測常用于蔬菜的兩種Ops殺蟲劑甲基對硫磷和毒死蜱，檢測范圍在1.0×1011-1.0×106M (0.6 < SD< 3.5)時傳感器有很好的再生能力和穩(wěn)定性。這種傳感器同樣可用于檢測水樣中的甲基對硫磷和毒死蜱。WenJing Chen等21報道了用毛細管柱法固定蛋白質的進展。在絲狀二氧化硅毛細管柱中固定蛋白質（酶），已經(jīng)在手性分離、定位肽、藥物篩

13、選、預富集等方面得到重要的應用。該文報道了固定蛋白質于毛細管柱的幾種方法，包括溶膠-凝膠法、物理吸附法、離子螯合吸附法、基本的液體蛋白質的固定和共價鍵法。 交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結構的固定化酶的方法。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應用最廣泛的是戊二醛。交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結合牢固，可以長時間使用。但由于交聯(lián)反應條件較激烈，酶分子的多個基團被交聯(lián)，致使酶活力損失較大，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不便。為此，可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，以取長補短。O. Stoilova等22報道了苯乙烯

14、-馬來樹脂酐共聚物的功能性電紡絲膜固定AChE。AChE在戊二醛做交聯(lián)劑以共價鍵的方式固定于修飾膜上，并測定了固定蛋白的用量和AChE的活性，被修飾的AChE顯示出很高的活性。固定酶的濃度為，pH為7，用體積比為10戊二醛做交聯(lián)劑。Tamara Lazarevi Pati等23用戊二醛做交聯(lián)將AChE固定在有活性的約束性氣孔玻璃上。張璐等24應用化學交聯(lián)法將巴西日圓線蟲乙酰膽堿酯酶固定于多壁碳納米管修飾的玻璃電極表面，制備了電化學生物傳感器用于檢測有機磷農(nóng)藥。Ovidiu Ilie Covaci等25報道了優(yōu)化硝基苯胺重鹽固定AChE于微電極用于靈敏檢測Ops殺蟲劑。本研究優(yōu)化了用對硝基苯胺重

15、鹽修飾AChE鉑金微電極。首先，對硝基苯基在電極表面沉淀然后分解；最后用戊二醛將酶交聯(lián)在氨基上。每一步制備的修飾電極都用CV和電化學交流阻抗光譜測定電極特性，中性pH修飾不同組分在電極上的變化。通過電位法、電流法和CV測試重鹽組分，只有電位法在表面沒有鈍化現(xiàn)象。使用微電極改進了檢測乙基對氧磷的檢測限與絲網(wǎng)印刷電極相比檢測限從100nM降到20nM。這種方法建構的電流型微生物傳感器穩(wěn)定、可再生，并適用于其他酶和電極材料。Michele Del Carlo等26報道了用普魯士藍修飾的絲網(wǎng)印刷電極獲得膽堿氧化酶生物傳感器檢測蜂蜜中的香豆磷。用戊二醛做交聯(lián)劑，通過交聯(lián)的方法固定膽堿氧化酶到PB-SPE

16、的表面。Xia Sun等27研制了基于普魯士蘭修飾乙酰膽堿酯酶生物傳感器用于檢測有機磷農(nóng)藥殘留。這種傳感器有雙模（殼聚糖膜和普魯士藍膜）修飾玻碳電極，殼聚糖28膜通過戊二醛交聯(lián)劑固定AChE，提高了識別殺蟲劑的選擇性。普魯士藍膜電沉積在GCE表面加快電子轉移。2.1.4 包埋法包埋法是將游離酶包埋于格子或微膠囊內，格子的結構可以防止酶滲出到周圍的培養(yǎng)基中，而底物分子仍能滲入格子內與酶接觸。包埋類型可有：網(wǎng)格型、微囊型及脂質體液膜型。包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進行結合反應，酶的空間結構很少改變，酶活性的回收率較高，可用于許多酶的固定化。但此法只適用于小分子反應的底物或產(chǎn)物，這樣才可以通

17、過高分子聚合物進行擴散。Dan Du29報道了基于碳納米管有微膠囊包著的多吡咯和聚苯胺共聚物的電流型AChE生物傳感器監(jiān)測OPs。合成的Pan-PPy-MWTNTs共聚物具有很好的滲透性和相同的形態(tài)，能理想的包埋酶分子。Georges Istamboulie等30用物理包埋法固定AChE和PTE于乙烯感光樹脂聚合物（AWP）中, AWP和酶的比例70:30 (v/v)。漩渦混勻混合液，并短時的離心消除泡沫。用微量注射器吸取3L混合液均勻滴在工作電極表面，在4 C的氖光下疊氮化合物中光聚3h，然后4 C下干燥48h。研制的AChE和PTE復酶生物傳感器能有效的區(qū)別毒死蜱和毒蟲畏的抑制作用。等31

18、研制了低成本集成電路片中制成人造神經(jīng)網(wǎng)（ANNs）研制出絲網(wǎng)印刷酶傳感器用于檢測殺蟲劑。用包埋法固定酶于光敏聚合物（AWP）乙烯醇上, AWP和酶溶液的比例為 70:30% (v/v)。用數(shù)字信號微控器完成人造神經(jīng)網(wǎng)設備，從而研制電流型AChE生物傳感器用于殺蟲劑混合物的分析。用數(shù)字信號微控器完成兩個ANNs對不同濃度的氧毒死蜱和毒死蜱在三個傳感器上的反應，得到較好的預測結果，已成為低成本分析化學檢測的專業(yè)方法。Dan Dua等32報道了固定AChE于-環(huán)式糊精于多壁碳納米管修飾玻碳電極，這種高靈敏性的電流型生物傳感器用于OPs殺蟲劑的經(jīng)檢測。通過聚合包埋法合成的復合材料的特性用傅立葉變換紅外

19、光譜(ATR-FTIR)和掃描電子顯微鏡表征(SEM)。由于-環(huán)式糊精于多壁碳納米管復合材料好的可分散性和滲透能力，為建構AChE生物傳感器提供了適宜的微環(huán)境，并能保持AChE的生物活性用于檢測OPs。MWCNTs在低電壓時能促進電子轉移反應和促進硫代膽堿電催化氧化，因此能提高檢測的靈敏性?；贠Ps對AChE活性的抑制，檢測樂果樣品，樂果抑制的濃度比例范圍是和2.44-10.00M,檢測限為2 nM (S/N = 3)。這種傳感器可再生性和穩(wěn)定性強，為分析酶的抑制提供了新的方法。B. Ebrahimi等33報道了響應面分析法優(yōu)化和評價用陶瓷包埋法固定AChE本方法用溶膠-凝膠-多壁碳納米管復

20、合材料支撐陶瓷圓管固定AChE，響應面分析法設計和分析固定反應，二次數(shù)學方程式預測酶的活性。優(yōu)化參數(shù)后的結果顯示出固定AChE于溶膠-凝膠-多壁碳納米管復合材料的活性高于用溶膠-凝膠或石墨溶膠-凝膠固定。并且，這種系統(tǒng)有高的穩(wěn)定性和可再生能力，分別在30，40，50min檢測得到的標準偏差為1.88%，2.11%和2.13%。 膽酶傳感器的電極材料2.2.1 納米碳Liu G等34通過一層一層的靜電自組裝AChE到多壁碳納米管上修飾玻碳電極。Yavor Ivanov等35研制了通過親和力作用固定專一位點的AChE到多壁碳納米管聚合膜的電流型生物傳感器，這種傳感器用于有機磷農(nóng)藥殘留的檢測，對樣品

21、溶液中對硫磷的檢測限為×1012gl1。2.1.2 金納米粒子Ivaylo Marinov等36制備了包溶金納米粒子的納米聚合膜的乙酰膽堿酯酶安培計型硫代乙酰膽傳感器，這種傳感器對對氧磷的檢測限為7.39×1011 gl1。LI Yan- Rong等37固定乙酰膽堿酯酶到一維金納米粒子上，研制了用于檢測有機磷殺蟲劑的傳感器。在優(yōu)化實驗條件下，對甲胺磷的檢測范圍-1。Dan Du等38報道了基于碲化鎘量子點(CdTe QDs )/金納米粒子有殼聚糖微球體修飾的AChE生物傳感器。CdTe QDs和GNPs結合提高了電子轉移，促進了硫代膽堿的電催化氧化，因此對酶作用物有很高的親

22、和力和敏感性，可快速方便的檢測久效磷。 納米復合材料Dan Du等39報道了一步合成碳納米管-金納米復合材料構建電流型AChE生物傳感器。合成的MWCNTs-Au納米復合材料為吸著生物分子提供了極易親水的表面，制備了穩(wěn)定的AChE生物傳感器。該傳感器能對Ops做出簡單而有效的生物監(jiān)測，以馬拉息昂為樣品，抑制比濃度范圍是和2-15g/ml，檢測限為。Alina C Ion等40研制了基于碳納米管-殼聚糖復合材料的乙酰膽堿酯酶伏安生物傳感器檢測有機磷殺蟲劑。因為納米材料增大了表面積和傳導性，AChE對硫代乙酰膽堿（ATCl）的親和力提高，快速反應形成了硫代膽堿。這種傳感器對ATCl濃度的響應曲線分

23、為兩段，一段為，另一段為，檢測限為1.58×1010M。Jingming Gong等41用一步電沉積方法構建了三維有孔鈣碳酸鹽-殼聚糖復合膜固定AChE的生物傳感器檢測殺蟲劑。用這種復合膜作為固定酶的基質，得到高靈敏性和穩(wěn)定性的AChE傳感器檢測甲基對硫磷，抑制甲基對硫磷的濃度比例范圍從到-1，檢測限為1ngml-1。Du D42等報道了碳納米管和金合成納米復合材料或結合殼聚糖構建AChE生物傳感器。Jingming Gong等43報道了用金-多吡咯網(wǎng)狀復合納米材料固定AChE修飾玻碳電極的生物傳感器檢測甲基對硫磷殺蟲劑。這種網(wǎng)狀納米材料不僅提供了用于保持AChE生物活性的生物微環(huán)境

24、，而且對檢測有機磷顯示出強大的協(xié)同效應。金納米粒子(AuNPs)和多吡咯納米線（PPyNWs）的結合促進酶的氧化產(chǎn)生硫代膽堿，增強了檢測的靈敏性，對甲基對硫磷的檢測限為-1。Yunhe Qu等44制備了層-層自組裝AChE/樹狀大分子聚酰胺-Au納米粒子到碳納米管上的修飾電極檢測殺蟲劑。電極上的碳納米管為固定AChE提供了適宜的環(huán)境，修飾的膜提高了電催化活性和膜與電極表面的電子轉移速度。對蟲螨威的響應線性范圍是×10-9M-0.9×10-7M，檢測限為4.0×10-9M。2.1.4 離子液體離子液體45是一種新型的有機溶劑，是在室溫或室溫附近溫度下呈液態(tài)的由離子構

25、成的物質，典型的離子液體是由有機陽離子和有機或無機陰離子構成的。與傳統(tǒng)的有機溶劑和電解質相比，離子液體具有一系列突出的優(yōu)點，例如幾乎無蒸汽壓，無可燃性，對有機、無機和有機金屬化合物有極好的溶解能力，液程寬，熱穩(wěn)定性高46。離子液體的無味、無惡臭、無污染、不易燃、易與產(chǎn)物分離、易回收、可反復多次循環(huán)使用、使用方便等優(yōu)點，是傳統(tǒng)揮發(fā)性溶劑的理想替代品，它有效地避免了傳統(tǒng)有機溶劑的使用所造成嚴重的環(huán)境、健康、安全以及設備腐蝕等問題，為名副其實的、環(huán)境友好的綠色溶劑。由于離子液體具有導電性、難揮發(fā)、不燃燒、電化學穩(wěn)定電位窗口比其它電解質水溶液大很多等特點，因此，離子液體已廣泛用于電化學的研究。Luci

26、an Rotariu等47研究了在碳納米管-離子液體(CNT-IL)凝膠傳感器上低壓硫代膽堿的氧化作用。比較了八種硫代膽堿傳感器的循環(huán)伏安和電流特性，得出在36-45A/mMcm2時選擇使用凝膠修飾的碳納米管-離子液體傳感器對檢測AChE有很好的靈敏性，已被用于檢測農(nóng)藥殘留。Muhammad Moniruzzaman等48對離子液體中酶反應的研究進展做了綜述?？偨Y了酶在離子液體中的反應活性、固定酶的方法、酶的穩(wěn)定性等。 溶膠-凝膠絲網(wǎng)印刷電極材料Andreescu 等49,50采用了聚合體和溶膠- 凝膠材料將AChE固定在絲網(wǎng)印刷電極上。高慧麗等51采用溶膠- 凝膠材料，將AChE固定在醋酸纖

27、維膜上，檢測有機磷農(nóng)藥的殘留。Michael Waibel 等52采用溶膠- 凝膠材料將乙酰膽堿酯酶固定在絲網(wǎng)印刷電極制備了農(nóng)藥殘留生物傳感器檢測對氧磷的檢測限為1g/L，檢測對硫磷的檢測限10g/L。Hanane Zejli等53建立了基于AChE的氧化鋁溶膠-凝膠/超聲凝膠-碳電極檢測有機磷農(nóng)藥，溫育10min，對氧甲基毒死蜱的檢測限為2.5×10-10M。Georges Istamboulie等54用絲網(wǎng)印刷聚合物（3,4-乙撐二氧噻吩）（PEDOT）作為電化學介質用于AChE生物傳感器，這種電極介質與傳統(tǒng)的電極介質相比顯示出高的傳導率，用于檢測有機磷農(nóng)藥中的氧化毒死蜱。2.3

28、 水果蔬菜中的有機磷農(nóng)藥殘留的檢測 周祖新等55以尼龍網(wǎng)為載體，采用共價鍵法固定酶，研制了乙酰膽堿酯生物傳感器用于水果中有機磷農(nóng)藥殘留的檢測。張君等56制備了用于水果蔬菜中檢測有機磷農(nóng)藥殘留的高靈敏絲網(wǎng)印刷酶電極，采用絲網(wǎng)印刷技術在PVC 板材上分步套印制出三電極， 然后在工作電極上通過分子交聯(lián)和Nafion 膜協(xié)同固定乙酰膽堿酯酶的新思路來制備的單酶型電化學生物傳感器。 邱朝坤等57對酶抑制法快速檢測有機磷農(nóng)藥殘留進行研究。以鯽魚腦、肝臟和肌肉乙酰膽堿酯酶(AChE)為檢測用酶，對白菜、青椒、西紅柿、豆角、空心菜中的敵敵畏、辛硫磷和毒死蜱有機磷農(nóng)藥的殘留進行檢測。藍炎陽等58研究了直接測定殘

29、留農(nóng)藥對乙酰堿酯酶的抑制率高低顯示農(nóng)藥殘留毒性水平 ，具有簡便、快速、準確、經(jīng)濟的特點，適用于水果中有機磷和氨暴甲酸酯類等農(nóng)殘的快速檢測。Josiane Caetano等59報道了通過抑制乙酰膽堿酯酶的活性檢測西紅柿中甲萘胺的安培計型生物傳感器。Dan Du等60報道了基于多吡咯和聚苯胺共聚物上參雜多壁碳納米管的乙酰膽堿酯酶電流型生物傳感器檢測有機磷農(nóng)藥的殘留。這種傳感器有很好的穩(wěn)定性和再生能力，對有機磷的檢測限為1.0 ng/mL。Huanshun Yin等61報道了將乙酰膽堿酯酶固定在金納米粒子和蠶絲蛋白上修飾鉑電極的電流型生物傳感器，用于檢測甲基對氧磷、蟲螨威和辛硫磷。蠶絲蛋白為酶分子提

30、供了適宜的生物環(huán)境，穩(wěn)定了生物活性，并且有效的阻止了酶從鉑電極表面脫落。硫代乙酰膽氯化物起氧化作用，金納米粒子能在電壓較低時促進電子轉移作用和促進硫代膽堿的電化學氧化作用，從而提高了檢測的靈敏性。這種傳感器對甲基對氧磷、蟲螨威和辛硫磷的檢測限分別為2×10-11M、1×10-10M、2×10-9M。2.4 水中的有機磷農(nóng)藥殘留的檢測 Alhareda62等用乙酰膽堿酯酶直接檢測自來水和果汁樣品中的對氧磷和敵百威。孟范平等63將乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)傳感器與流動注射系統(tǒng)(flow injection analysis sy

31、stem，F(xiàn)IA)相結合。通過光學方法測定固定化酶受農(nóng)藥抑制后的殘余活性，對海水中微量甲基對硫磷進行定量分析。在01100gL之間，農(nóng)藥濃度的對數(shù)值與固定化酶活性的抑制率之間具有良好的線性關系(r=0995 3)。利用該系統(tǒng)檢測含甲基對硫磷分別為08 gL和50 L的模擬海水樣品，獲得了較好的準確度和精密度，平均相對誤差和變異系數(shù)均小于1O。Lu Zhang等64應用化學交聯(lián)法將巴西日圓線蟲乙酰膽堿酯酶(AChE)固定于多壁碳納米管修飾的玻碳電極表面，制備用于有機磷農(nóng)藥檢測的電化學生物傳感器。測定了湖水中馬拉硫磷的含量，回收率為97%105%。響應電流與馬拉硫磷的濃度在6. 0 ×1

32、0 - 10 6. 0 ×10 - 9 mol·L - 1范圍內呈良好的線性關系，檢出限為1.0 ×10- 10 mol·L1。陳向強等65采用絲網(wǎng)印刷技術制作厚膜型電極， 通過交聯(lián)法將乙酰膽堿酯酶固定在電極上， 開發(fā)快速檢測水中有機磷農(nóng)藥的酶傳感器。 在交聯(lián)固定酶的情況下， 根據(jù)酶活受到有機磷抑制的原理， 采用時間-電流法對特丁硫磷和對硫磷進行了檢測。結果表明:這兩種有機磷的檢測限都可以達到1 ng/ mL。3 發(fā)展趨勢因為納米顆粒具有表面效應、尺寸效應、量子效應和宏觀量子隧道效應，與常規(guī)表面活性材料相比表面活性位置增加，吸附點位置增多，因而增加了化學

33、反應的接觸面和催化能力，可以作為優(yōu)良的電極材料。而離子液體具有熔點低、穩(wěn)定性高、溶解能力強、導電性高、蒸汽壓低電勢窗寬等普通有機溶劑和水而不具備的獨特性質，已被廣泛的應用于電化學領域。此外，離子液體還具有良好的生物相容性，是一些生物分子電催化過程中的理想介質。因而納米粒子與離子液體復合材料能進一步改善和提高傳感器的性能，如可提高生物催化活性，加快電子轉移和具有協(xié)同催化作用等。合成功能化的離子液體和納米材料有效的結合，改善傳感器的整體性能。提高AChE檢測的靈敏度，使之更方便快捷的檢測有機磷農(nóng)藥。優(yōu)化電極結構，尋求AChE在電極表面固定的新方法；納米粒子與離子液體復合材料復合成分的選擇、復合物制

34、備方法，從而獲得優(yōu)良性能的復合物，進而提高傳感器的靈敏度、選擇性、穩(wěn)定性、電催化活性及生物兼容性。參考文獻1 Qiuhua Wu, Xin Zhou ,Yuemin Li, Application of dispersive liquid-liquid microextraction combined with high-performance liquid chromatography to the determination of carbamate pesticides in water samplesJ. Anal Bioanal Chem (2009) 393:17551761.2

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