HPLC法測(cè)定注射用胸腺肽α1的含量

1、HPLC法測(cè)定注射用胸腺肽1的含量        【摘要】  目的：改進(jìn)注射用胸腺肽1含量測(cè)定的方法。方法：色譜柱為L(zhǎng)una C18( 5m ，4.6mm×250mm)；流動(dòng)相A為0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH5.7)乙腈(928)，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量20L。結(jié)果：胸腺肽1在0.050.8mg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，r = 0.9999，平均回收率為99.4%。結(jié)論：改進(jìn)后的方法操作簡(jiǎn)單，省時(shí)，重復(fù)

2、性好，進(jìn)一步完善了產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 【關(guān)鍵詞】  高效液相色譜法；注射用胸腺肽1；含量測(cè)定ABSTRACT Objective: To improve the content determination method for thymopetidum 1  injection. Methods：Content of 20L thymopetidum injection was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) instrument fixed with a Luna C18 (5 m ,4

3、.6 mm×250mm). The mobile phase A was water with 0.05 mol/L KDP (pH5.7) and AN（928）, mobile phase B was AN, and gradient elution was used. The flow rate was 1.0 mL/min, detective wavelength was 210 nm and column temperature was room temperature. Results：The linear range for content of thymopetid

4、um 1 injection was 0.050.8 mg/mL, r=0.9999, the average recovery was 99.4%. Conclusion：The improved determination method is simple, timesaving with good repeatability, and can help to improve the quality standards of injective thymopetidum.    KEY WORDSHigh performance liquid chromato

5、graphy (HPLC)；Thymopetidum 1 injection；Content determination    注射用胸腺肽1主要成分為胸腺肽1，是化學(xué)合成的28肽，臨床用于慢性乙型肝炎和作為免疫損害病者的疫苗免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑。在2010年版藥典二部中收錄的注射用胸腺肽1標(biāo)準(zhǔn)1和國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的藥品試行標(biāo)準(zhǔn)（YBH26822005）中規(guī)定的含量測(cè)定方法，梯度洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，操作繁瑣且重復(fù)性較差。本實(shí)驗(yàn)對(duì)注射用胸腺肽1含量測(cè)定方法進(jìn)行了改進(jìn)，現(xiàn)報(bào)道如下。1  試藥與儀器1.1  試藥    胸

6、腺肽1對(duì)照品及注射用胸腺肽1（海南某藥品研發(fā)公司提供），對(duì)照品含量：99.78%，乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純。1.2  儀器     Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；DAD二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）。2  實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果2.1  色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)    色譜柱：Luna C18 ( 5m ，4.6mm×250mm)；以0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH5.7)乙腈(928)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，采用梯度洗脫，在8min之內(nèi)流

7、動(dòng)相B由3%增加到9%，在2min之內(nèi)流動(dòng)相B降為3%，并平衡5min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，進(jìn)樣量20L，理論板數(shù)按胸腺肽1峰應(yīng)大于5000。2.2  測(cè)定方法      余邦良等.HPLC法測(cè)定注射用胸腺肽1的含量  取本品適量，用0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH6.8)溶解，制成1mL中約含胸腺肽1 0.1mg的溶液，作為供試品溶液（臨用前配制），精密量取20L，注入液相色譜儀，參照高效液相色譜法2，記錄色譜圖；另精密稱(chēng)取胸腺肽1對(duì)照品適量，用0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH6.8)溶解，制成1mL中約

8、含胸腺肽1 0.1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液（臨用前配制），同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，其平均含量應(yīng)符合規(guī)定。2.3  輔料干擾試驗(yàn)    按處方量精密稱(chēng)取甘露醇、氫氧化鈉，并另取注射用胸腺肽1，按“2.2項(xiàng)”制成輔料溶液和供試品溶液，分別取20L注入液相色譜儀，按含量測(cè)定法記錄色譜圖（圖1、2），從圖譜上可以看出, 這些輔料在主峰吸收處均無(wú)吸收，故不影響注射用胸腺肽1含量的測(cè)定。圖1  空白輔料色譜圖圖2  注射用胸腺1色譜圖2.4  回收率試驗(yàn)    稱(chēng)取按處方量計(jì)算的輔料9份，分別加入

9、標(biāo)示量80%、100%、120%的胸腺肽1，每種標(biāo)示量各3份樣，分別置相應(yīng)的量瓶中，按“2.2項(xiàng)”制成供試品溶液，按含量測(cè)定方法，記錄色譜圖，計(jì)算其回收率。平均回收率為99.4%，RSD為0.25%。2.5  精密度試驗(yàn)     取同一批號(hào)的注射用胸腺肽1 6瓶，按“2.2項(xiàng)”制成供試品溶液，按含量測(cè)定方法，每個(gè)供試品溶液平行測(cè)定6次，記錄色譜圖，主峰面積的RSD為0.34%。1         2.6  配液穩(wěn)定性試驗(yàn)   

10、  取注射用胸腺肽1適量，按“2.2項(xiàng)”制成供試品溶液，將其放置在2025的室溫下，分別于配樣后第0、2、4、8、12h取樣按含量測(cè)定方法分析，主峰面積的RSD為0.54%，結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)較穩(wěn)定。2.7  線(xiàn)性試驗(yàn)    取注射用胸腺肽1適量，按“2.2項(xiàng)”制成1mL中約含胸腺肽1 1mg的溶液，并分別稀釋成含胸腺肽1 0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/L 的溶液，按含量測(cè)定方法測(cè)定，記錄色譜圖，以進(jìn)樣濃度X（mg/L ）為橫坐標(biāo)，胸腺肽1峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。其線(xiàn)性方程為：Y=18980X+1348

11、0433，r=0.9999。線(xiàn)性范圍0.050.8mg/L。2.8  樣品含量測(cè)定    取注射用胸腺肽1 8瓶（1.6mg/瓶），各瓶精密加入0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH6.8)1.6mL溶解，合并，精密吸取5mL置50mL量瓶中，稀釋至刻度，制成1mL中約含胸腺肽1 0.1mg的溶液，作為供試品溶液（臨用前配制），精密量取20L，注入液相色譜儀，按高效液相色譜法2，記錄色譜圖；另取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的胸腺肽1對(duì)照品適量，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算其平均含量。3批樣品含量分別為100.9%、100.1%、100.2%。  3  討論    原法 “YBH26822005” 的含量測(cè)定的梯度洗脫，在20min內(nèi)流動(dòng)相B由0增加到9%，然后在1min內(nèi)流動(dòng)相B降為0，并用流動(dòng)相A平衡10min。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該法耗時(shí)長(zhǎng)，且重現(xiàn)性差。本文對(duì)其梯度洗脫法進(jìn)行修改：在8min之內(nèi)流動(dòng)相B由3%增加到9%，在2min之內(nèi)流動(dòng)相B降為3%，并平衡5min。    通過(guò)方法