rhIL-3影響K562細胞對阿糖胞苷敏感性的研究

1、    rhIL-3影響K562細胞對阿糖胞苷敏感性的研究        我們以前的研究表明，在體外重組人白細胞介素3(rhIL-3)能增強急性髓系白血病(AML)細胞對柔紅霉素(DNR)的敏感性1。阿糖胞苷(Ara-C)是國際AML化療的標準方案（DA方案）中的主要藥物，且DNR和Ara-C對白血病細胞的作用機制不同。我們以AML細胞株K562細胞為模型，觀察rhIL-3聯(lián)合Ara-C對K562細胞集落(CFU-L)生長的影響，并通過3H-Ara-C摻入和測定白細胞分化抗原

2、CD14、CD15表達，探討其影響的機制和意義。 材料和方法1K562細胞株引自重慶醫(yī)科大學組織胚胎教研室。2試劑rhIL-3，日本Kirin公司產(chǎn)品，活性1×108U/mg。鹽酸阿糖胞苷，Upjoh公司產(chǎn)品。3H-Ara-C，Amersham公司產(chǎn)品，放射性活度925GBq/mmol。小鼠抗人單克隆抗體(單抗)CD14、CD15和異硫氰酸酯熒光素(FITC)標記的兔抗鼠抗體（二抗）均購自軍事醫(yī)學科學院。3K562細胞培養(yǎng)K562細胞培養(yǎng)液為含體積分數(shù)為10%的小牛血清的RPMI 1640液。置細胞于37，體積分數(shù)為5%的CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)，每34d換液傳代。換液時1500r

3、/min離心5min，棄上清液，細胞數(shù)調(diào)至1×105/ml，10ml/瓶。細胞經(jīng)多次傳代后至指數(shù)生長且死細胞數(shù)<5%時進行實驗。4液體懸浮培養(yǎng)將指數(shù)生長期K562細胞調(diào)成5×105/ml細胞濃度懸液，以10ml/瓶為一體系，實驗組加入rhIL-3，濃度分別調(diào)至10U/ml,100U/ml,1000U/ml；對照組不加rhIL-3，每組2瓶，置37，體積分數(shù)為5%的CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)23d。53H-Ara-C摻入試驗將懸浮培養(yǎng)的K562細胞移入96孔培養(yǎng)板中，每孔0.2ml，加3H-Ara-C(100ng/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24h，收獲在醋酸纖維膜上，用液閃儀測定各

4、孔放射性核素每分鐘閃爍計數(shù)(CPM)值，以3孔平均值作為3H-Ara-C摻入量。6細胞集落半固體培養(yǎng)及藥敏試驗取液體懸浮培養(yǎng)的細胞，加入Ara-C(100ng/ml)后作用24h，按文獻2方法進行CFU-L半固體培養(yǎng)，觀察細胞集落產(chǎn)率情況，按液體懸浮培養(yǎng)時的分組分別計算集落產(chǎn)率。    7白血病細胞分化抗原表達測定液體懸浮培養(yǎng)3d的K562細胞懸液離心棄上清，用PBA(PBS+體積分數(shù)為20%的小牛血清)洗2次，分別加入CD14、CD15單抗（一抗），4 30min。用PBA洗2次，加入二抗，4 30min。PBS洗2次后，用流式細胞儀檢測1×

5、104個細胞，設(shè)立陰性對照去除非特異性熒光，儀器用雞紅細胞作標準，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm，數(shù)據(jù)經(jīng)計算機處理，計算陽性細胞百分率。結(jié)果1rhIL-3對3H-Ara-C摻入K562細胞的影響 經(jīng)不同濃度rhIL-3作用后K562細胞內(nèi)3H-Ara-C摻入值均明顯高于未經(jīng)rhIL-3處理的K562細胞內(nèi)3H-Ara-C摻入值(P<0.05或P<0.01)，并且CPM值的增高與rhIL-3的濃度呈劑量依賴關(guān)系(見1)。     1rhIL-3對3H-Ara-C摻入K562細胞的影響2rhIL-3聯(lián)合Ara-C對CFU-L生長的影響rh

6、IL-3+Ara-C組CFU-L產(chǎn)率為(18.33±4.21)%，單純Ara-C組為(38.68±7.20)%，兩組比較，差異有顯著性意義(P<0.01)。3rhIL-3對K562細胞分化抗原表達的影響K562細胞經(jīng)rhIL-3作用3d，與對照組比較，細胞分化抗原CD14、CD15表達陽性率差異無顯著性意義(P>0.05)，見表1。組別CD14陽性率(%)CD15陽性率(%)對照組rhIL-3組*注：與對照組比較，*P>0.05 討論白血病細胞存在較多非增殖期（G0）或慢增殖細胞，這些細胞的存在是白血病化療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因之一3。我們曾以原代AML細胞

7、體外培養(yǎng)為模型，證實rhIL-3具有刺激增加S期白血病細胞比例的作用1。Ara-C是已知作用于細胞S期的特異性藥物。我們觀察不同濃度rhIL-3作用后K562細胞3H-Ara-C摻入情況，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度rhIL-3刺激后，K562細胞內(nèi)3H-Ara-C摻入率較對照組增加近0.51.5倍。進一步半固體CFU-L培養(yǎng)的結(jié)果表明，rhIL-3聯(lián)合Ara-C作用后，CFU-L產(chǎn)率比對照組顯著減低。CD14、CD15為表達于較成熟的粒-單核細胞表面的抗原，觀察K562細胞CD14、CD15的表達可從一個方面了解細胞的分化情況，我們的測定結(jié)果顯示，rhIL-3(100U/ml)對K562細胞CD14

8、、CD15表達陽性率無明顯影響，提示在本實驗條件下，rhIL-3對K562細胞無誘導(dǎo)分化作用，因此認為rhIL-3(100U/ml)與Ara-C聯(lián)合可增強K562細胞對Ara-C的敏感性。其機制可能是rhIL-3刺激后使G0期或慢增殖的白血病細胞進入S期，從而有利于Ara-C摻入細胞DNA，加速白血病細胞死亡。作者單位: 王景昌(733000甘肅省武威市，解放軍第十醫(yī)院內(nèi)科)周大柱(733000甘肅省武威市，解放軍第十醫(yī)院內(nèi)科)孫勝德(733000甘肅省武威市，解放軍第十醫(yī)院內(nèi)科)羅莉(733000甘肅省武威市，解放軍第十醫(yī)院內(nèi)科)張侃如(733000甘肅省武威市，解放軍第十醫(yī)院內(nèi)科)王慶余(

9、第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院血液科)謝家印(第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院血液科)參考文獻1，王景昌，王慶余. rhIL-3增強急性髓系白血病細胞對柔紅霉素敏感性的研究. 中華血液學雜志，1999,20:30-32.2，Boekhorst PA,Lowerberg B, Sonneveld P. Enhanced chemosensitivity in acute myeloid leukemia by the haematopoietic growth factor:a comparison of MTT assay with a clonogenic assay. Leukemia, 1993,7:1637