熒光定量PCR聯(lián)合ELISA檢測(cè)丙型肝炎病毒的臨床應(yīng)用研究

1、熒光定量PCR聯(lián)合ELISA檢測(cè)丙型肝炎病毒的臨床應(yīng)用研究    我國(guó)一般人群抗-HCV陽(yáng)性率為3.21，急性丙型肝炎絕大多數(shù)都將形成慢性丙型肝炎，是形成肝硬化和肝癌的重要原因2。目前，醫(yī)院和血站大多采用ELISA法檢測(cè)血清中抗-HCV來(lái)診斷可疑感染者和篩選獻(xiàn)血員。     作者：高英英，馬雷，孫玉鴻    作者單位：佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，黑龍江 佳木斯 154003；佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯 154003   【摘要】  目的：

2、探討熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）聯(lián)合檢測(cè)丙型肝炎病毒的臨床意義。方法：用FQ-PCR聯(lián)合ELISA方法檢測(cè)117例臨床已確診為丙型肝炎患者的血清，同時(shí)檢測(cè)它們的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AAT）。結(jié)果：抗-HCV陽(yáng)性率隨著HCV-RNA含量的升高而增高，其陽(yáng)性率與HCV-RNA含量呈正相關(guān)。87例HCV-RNA陽(yáng)性標(biāo)本中，有50例ALT異常，其異常率隨著HCV-RNA含量的升高而增高，ALT異常率與HCV-RNA含量呈正相關(guān)， ALT水平和HCV-RNA含量之間呈正相關(guān)。FQ-PCR檢測(cè)敏感性為74.4%(87/117)，漏檢率為25.6%（30/117）

3、。ELISA法檢測(cè)敏感性為76.9%（90/117），漏檢率為23.1%（27/117）。兩種方法聯(lián)合檢測(cè)敏感性為92.3%(108/117)，漏檢率為7.7%（9/117）。結(jié)論：兩種方法聯(lián)合檢測(cè)，互相補(bǔ)充，大大提高了丙型肝炎病毒的檢出率，為臨床早期，準(zhǔn)確診斷丙型病毒肝炎、監(jiān)測(cè)病情、觀察療效提供了有力的依據(jù)，為獻(xiàn)血人員篩選和血制品安全提供了有力保障。 【關(guān)鍵詞】  丙型肝炎病毒核酸；丙型肝炎病毒抗體；熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 Detection of hepatitis C virus by FQ-PCR and ELISA: Clinical

4、 application GAO Yingying，MA Lei，SUN Yuhong     1.The Clinical Medical College of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China;2.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China     Abstract:Objective:To discuss the clinical significance of detectio

5、n of hepatitis C virus by FQ-PCR and ELISA.Methods:We detected of 117 sera of clinical patients who had been diagnosed as hepatitis C,and at the same time tested their alanine aminotransferase(AAT).Results: Anti-HCV's positive rate rose with HCV-RNA content increase. By using correlation analysi

6、s,anti-HCV positive rate and  HCV-RNA content showed positive correlation.There were 50 AAT abnormal ones in 87 HCV-RNA positive samples.AAT abnormal rate rose with HCV-RNA content increase,showing positive correlation by using correlation analysis, and  there was a positive correlation be

7、tween the AAT level and HCV-RNA content.FQ-PCR detection sensitivity was 74.4%(87/117),and omission factor was 25.6%（30/117）.ELISA detection sensitivity was 76.9%（90/117）,and omission factor was 23.1%（27/117）.Combined detection sensitivity of two kinds of methods was 92.3%(108/117),and omission fact

8、or was 7.7%（9/117）.Combined detection sensitivity was higher than that of separate.Conclusion:The combined detection  is complementary,and greatly improves the hepatitis C virus detection rate,providing a powerful basis for clinical early and accurate diagnosis of hepatitis C virus,condition mo

9、nitoring,and clinical observation, and providing a strong support for screening blood donors and safety of blood products.     Key words:HCV-RNA；anti-HCV；FQ-PCR；ELISA；AAT 我國(guó)一般人群抗-HCV陽(yáng)性率為3.21，急性丙型肝炎絕大多數(shù)都將形成慢性丙型肝炎，是形成肝硬化和肝癌的重要原因2。目前，醫(yī)院和血站大多采用ELISA法檢測(cè)血清中抗-HCV來(lái)診斷可疑感染者和篩選獻(xiàn)血員。但ELISA法檢測(cè)血清抗-H

10、CV敏感性不高，存在30左右的漏檢率3,4，耽誤了一部分患者疾病的治療和引起輸血后HCV感染的流行。因此，我們用FQ-PCR聯(lián)合ELISA方法檢測(cè)117例臨床已確診為丙型肝炎患者的血清，并同時(shí)檢測(cè)血清ALT。探索能夠提高丙型肝炎病毒檢出率的方法，為臨床診斷丙型病毒肝炎，判斷病情和療效提供參考依據(jù)。     1  對(duì)象和方法     1.1  對(duì)象     選取佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院200601200708門(mén)診和住院患者117例，男67例，女50例，年齡1473歲，平均45.0歲。全部病

11、例均為已確診慢性丙型肝炎患者，排除其它型肝炎引起肝損傷的患者。診斷嚴(yán)格按照2000年西安中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)分會(huì)、肝病學(xué)會(huì)聯(lián)合修訂的病毒性肝炎防治診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)HCV-RNA含量(拷貝/mL)將資料分為<1×102、1024、1045、1056和>1065個(gè)組。       1.2  方法     1.2.1  血清HCV-RNA定量檢測(cè)     HCV-RNA的檢測(cè)采用FQ-PCR，試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供，核酸擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公

12、司的PE7700型全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，參考值<1×102拷貝/mL。     1.2.2  抗-HCV檢測(cè)     抗-HCV檢測(cè)采用ELISA法，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，試劑盒由沈陽(yáng)惠民生物工程有限公司提供。     1.2.3  ALT檢測(cè)     血清ALT檢測(cè)采用酶動(dòng)力學(xué)法，正常參考值：540U/L(37)，試劑采用日本和光試劑，檢測(cè)儀器為日本Olympus AU1000全自動(dòng)生化分析儀。    

13、; 1.2.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理     采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較用t檢驗(yàn)，對(duì)HCV-RNA含量的對(duì)數(shù)值與ALT含量進(jìn)行線性相關(guān)關(guān)系分析和相關(guān)性顯著性檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。     2  結(jié)果     2.1  HCV-RNA含量與血清抗-HCV表達(dá)     見(jiàn)表1。117例標(biāo)本經(jīng)FQ-PCR定量檢測(cè)，有87例HCV-RNA含量高于1×102拷貝/mL，其

14、中抗-HCV陽(yáng)性75例，陽(yáng)性率為86.2%（75/87），而低于1×102拷貝/mL血清標(biāo)本中，抗-HCV陽(yáng)性率為50.0%(15/30) ，經(jīng)相關(guān)性分析，兩者有明顯相關(guān)性(2=16.474，P<0.05)?？?HCV陽(yáng)性率隨著HCV-RNA含量的升高而增高，經(jīng)相關(guān)性分析，其陽(yáng)性率與HCV-RNA含量呈正相關(guān)(r=0.881，P<0.05)。表1  117例標(biāo)本HCV-RNA含量及抗-HCV檢測(cè)結(jié)果（略） 2.2  HCV-RNA含量與血清ALT含量關(guān)系     見(jiàn)表2。從表2中可看出，87例HCV-RNA含量高于1

15、15;102拷貝/m血清標(biāo)本中，有50例ALT異常，其異常率隨著HCV-RNA含量的升高而增高，經(jīng)相關(guān)性分析，ALT異常率與HCV-RNA含量呈正相關(guān)(r=0.921，P<0.05)，而ALT水平和HCV-RNA含量之間亦呈正相關(guān)(r=0.894，P<0.05)。表2  117例標(biāo)本HCV-RNA與血清ALT含量關(guān)系（略） 2.3  FQ-PCR聯(lián)合ELISA檢測(cè)結(jié)果     見(jiàn)表3。FQ-PCR檢測(cè)敏感性為74.4%(87/117)，漏檢率為25.6%（30/117）。ELISA法檢測(cè)敏感性為76.9%（90/117），漏檢率為2

16、3.1%（27/117），兩種方法檢測(cè)血清標(biāo)本敏感性差異無(wú)顯著性（2=0.208，P>0.05)。兩種方法聯(lián)合檢測(cè)敏感性為92.3%(108/117)，漏檢率為7.7%（9/117）。聯(lián)合檢測(cè)敏感性明顯高于單獨(dú)檢測(cè) (2=10.636，P<0.05)。表3  各種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)丙肝病毒敏感性比較（略） 3  討論     HCV-RNA檢測(cè)是診斷HCV感染的直接可靠的指標(biāo)，F(xiàn)Q-PCR方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高和操作簡(jiǎn)捷等優(yōu)點(diǎn)?？?HCV試劑采用間接酶聯(lián)免疫法，國(guó)內(nèi)多采用第三代抗-HCV ELISA試劑，它包被的抗原為H

17、CV抗原、NS3、NS4和NS5抗原，特異性達(dá)到99.0%。本研究中HCV-RNA陽(yáng)性率為74.4%，漏檢率為25.6%。有15例標(biāo)本HCV-RNA陰性，而抗-HCV陽(yáng)性。這可能與抗-HCV抗體為IgG類(lèi)抗體，特異性差，維持時(shí)間長(zhǎng)、患者接受抗病毒治療后，HCV復(fù)制受限、血液中HCV-RNA含量呈階段性變化、病毒株發(fā)生變異等因素有關(guān)5,6。抗-HCV陽(yáng)性率為76.9%，漏檢率為23.1%。有18例標(biāo)本抗-HCV陰性，而HCV-RNA陽(yáng)性。漏檢率高的原因可能是由于部分患者處于感染的早期階段，機(jī)體未產(chǎn)生免疫應(yīng)答或弱表達(dá)，而未產(chǎn)生抗體、或者產(chǎn)生的抗體過(guò)少，而檢測(cè)不到、還可能是病毒株發(fā)生了變異等原因。兩

18、種方法聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率為92.3%，漏檢率為7.7%，二者互相補(bǔ)充，大大提高了丙型肝炎病毒的檢出率。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，抗-HCV指標(biāo)陽(yáng)性率隨HCV-RNA含量的增高而增高，ALT異常率及平均含量隨HCV-RNA含量的增高而增高。對(duì)患者血清HCV-RNA含量的對(duì)數(shù)值與ALT含量進(jìn)行相關(guān)性分析和相關(guān)性顯著性檢驗(yàn)，表明HCV-RNA含量與ALT水平呈正相關(guān)。ALT水平升高反映肝細(xì)胞破壞程度加劇，ALT下降表示抗病毒的治療取得療效，提示HCV-RNA含量與肝功能損傷呈正相關(guān)。     綜上所述，F(xiàn)Q-PCR和ELISA聯(lián)合檢測(cè)為臨床早期，準(zhǔn)確診斷丙型病毒肝炎、監(jiān)測(cè)病情、觀察療效提供了有力的依據(jù)，為獻(xiàn)血人員篩選和血制品安全提供了有力保障。 【參考文獻(xiàn)】   1中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì).丙型肝炎防治指南J.中華肝臟雜志,2004,12:194198    2Sarra