His肽修飾的人干擾素γ的研制

1、His肽修飾的人干擾素的研制胡大強(qiáng) (第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所藥劑科，重慶400042)提 要：目的 為了便于人干擾素功能研究，制備6His修飾的人干擾素。方法 采用一步反向PCR擴(kuò)增編碼人干擾素的cDNA序列,克隆到質(zhì)粒pUC19,測(cè)序鑒定正確后構(gòu)建到pQE80L表達(dá)質(zhì)粒中，經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切后，行1.2% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定；利用SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)表達(dá)的目的蛋白, Ni2+-NTA柱純化蛋白，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定純化的目的蛋白。結(jié)果 一步反向PCR擴(kuò)增得到編碼人干擾素 cDNA片段，測(cè)序結(jié)果正確,SDS-PAGE和Western blot分

2、析顯示His修飾的人干擾素在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá), SDS-PAGE證實(shí)目的蛋白具有較高純度，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定顯示目的蛋白具有高的生物活性。結(jié)論 成功制備了6His肽修飾的人干擾素。關(guān)鍵詞：干擾素；表達(dá)；蛋白純化 Keywords: human interferon gamma; expession;protein purification人干擾素（Human interferon gamma,huINF）具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用1，臨床上廣泛使用。但在huINF的功能研究中，常需要對(duì)huINF進(jìn)行定性或定量，一般使用huINF的單抗，采用酶聯(lián)免疫法來(lái)定性或定量。His肽單抗作為

3、成熟產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)室已常規(guī)使用，制備6His修飾的人干擾素不需其單抗，采用His肽單抗即可對(duì)其定性或定量，有助于干擾素的研究工作。本文采用基因工程技術(shù)，把6His肽結(jié)合到人干擾素的N端上，制備6His 修飾的人干擾素。1 材料與方法 質(zhì)粒和菌株 pUC19、pQE80L質(zhì)粒和DH5菌株，由本實(shí)驗(yàn)組保存。1.2 試劑和儀器 Tripure RNA提取試劑為Roche公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII, DNA聚合酶，T4連接酶購(gòu)自大連寶生物公司。PT-PCR試劑盒為美國(guó)Promga公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段膠回收和PCR產(chǎn)物回收試劑盒為美國(guó)Omega公司產(chǎn)品，引物由上海生工公

4、司合成，抗-His單抗和Ni2+-NTA層析系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)為美國(guó)sigma公司產(chǎn)品，卡介菌多糖核酸注射液為湖南斯奇生物制藥有限公司產(chǎn)品。1.3 引物的設(shè)計(jì)合成 為得到實(shí)驗(yàn)所需目的片段,我們?cè)O(shè)計(jì)了擴(kuò)增去掉信號(hào)肽的huIFN引物。上、下游引物分別選用BamHI和HindIII兩個(gè)酶切位點(diǎn)，引物序列如下：上游引物：5-gtggatccc agg acc cat atg taa aag-3，下游引物：5-ggc aag ctt tta ctg gga tgc tct tc。1.4 人單個(gè)核細(xì)胞（pBMC）總RNA提取 首次接受卡介菌多糖核酸注射液用藥的病人

5、，im 36 h后，取靜脈血10 mL 到預(yù)先加入肝素0.2 mL 的離心管中,采用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，再提取pBMC總RNA。有關(guān)操作依照RNA提取試劑盒說(shuō)明操作,所得總RNA保存在70%乙醇中于-70儲(chǔ)存。1.5 PT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增編碼huIFN片段 采用PT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出編碼huIFN cDNA片段。PT-PCR反應(yīng)以pBMC總RNA為模板。循環(huán)條件：45反轉(zhuǎn)錄45min；94 2min激活熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶；以cDNA第一鏈為模板,94 30s,57 1min,68 2min,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后68延伸7min。回收RT-PCR產(chǎn)物中的目的片段,經(jīng)BamHI和

6、HindIII雙酶切, 0.8%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳后膠回收huIFN片段，構(gòu)建在pUC19上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5細(xì)菌，藍(lán)白斑篩選，挑選白斑單克隆接種培養(yǎng)后,小量法提取質(zhì)粒,進(jìn)行雙酶切鑒定，送陽(yáng)性重組質(zhì)粒細(xì)菌測(cè)序。1.6 pQE80L/huIFN表達(dá)載體的構(gòu)建 將測(cè)序正確的重組 pUC19/huIFN質(zhì)粒經(jīng)小量法提取, 經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切后瓊脂糖電泳膠回收huIFN片段,構(gòu)建到pQE80L載體上。再轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5細(xì)菌,氨芐青霉素抗性篩選，挑選轉(zhuǎn)化單克隆接種培養(yǎng)后,小量法提取質(zhì)粒,進(jìn)行雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆。 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)挑取含重組原核表達(dá)載體的單個(gè)菌落接種于LB培養(yǎng)液中,37,2

7、25-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,次日以1%接種到5mL LB培養(yǎng)液中,37,振蕩培養(yǎng)至A600為0.6時(shí),加IPTG至終濃度為-1,繼續(xù)培養(yǎng)4h。 SDS-PAGE 參照現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行2,以15%的聚丙烯酰胺為分離膠,濃縮膠濃度為5%,取上述培養(yǎng)液1mL,離心10000g,1min,沉淀加100L 1×上樣緩沖液,100煮10 min,取20L上樣,電泳后,行考馬斯亮藍(lán)染色。 Western blot分析 經(jīng)誘導(dǎo)的pQE80L/huIFN/DH5工程菌行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,將凝膠上的蛋白半干法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,麗春紅S染色后標(biāo)出marker的位置,去離子水洗去膜上的

8、麗春紅S, 5%脫脂奶粉室溫封閉,加抗His單抗孵育,洗滌后加HRP標(biāo)記的第二抗體室溫孵育1h,洗膜后加DAB閉光顯色。1.10 Ni2 +-NTA親和層析柱純化重組蛋白將含重組質(zhì)粒pQE80L/huIFN的表達(dá)菌在500 ml LB中擴(kuò)增培養(yǎng)(方法同) ,離心收集菌體,超聲碎菌,離心沉淀得包涵體,用緩沖液A (8 mol/L尿素、0.1 mol/L磷酸二氫鈉、0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0)裂解,裂解上清過(guò)Ni2 +-NTA層析柱,依次用緩沖液A和緩沖液-1 尿素、0.-1磷酸二氫鈉、0.1 Tris-HCl pH 6.3 ) 洗柱, 直至A280小于0.001,用緩沖

9、液C (緩沖液B中含0.-1咪唑)洗脫目的蛋白，采取逐步降低尿素濃度的方法,透析除去純化蛋白溶液中的尿素,使變性蛋白在此過(guò)程中自然復(fù)性,凍干得到huIFN，行SDS-PAGE分析制備蛋白純度。1.11 ELISA檢測(cè)huIFN稱取制備的huIFN適量，用PBS稀釋到7-1000 L-1范圍，采用人干擾素 ELISA試劑盒測(cè)定。2 結(jié)果 2.1 RT-PCR擴(kuò)增的huIFN cDNA片段 1.2%瓊脂糖凝膠電泳顯示在480bp處有一特異擴(kuò)增條帶,片段大小與理論預(yù)期值一致，見圖1（略）。2.2 DNA序列測(cè)定結(jié)果 所獲huIFN的cDNA序列為：5-CAGGACCCATA TGTAAAAGAA G

10、CAGAAAACC TTAAGAAATA TTTTAATGCA GGTCATTCAG ATGTAGCGGA TAATGGAACT CTTTTCTTAG GCATTTTGAA GAATTGGAAA GAGGAGAGTG ACAGAAAAAT AATGCAGAGC CAAATTGTCT CCTTTTACTT CAAACTTTTT AAAAACTTTA AAGATGACCA GAGCATCCAA AAGAGTGTGG AGACCATCAA GGAAGACATG AATGTCAAGT TTTTCAATAG CAACAAAAAG AAACGAGATG ACTTCGAAAA GCTGACTAAT TATT

11、CGGTAA CTGACTTGAA TGTCCAACGC AAAGCAATAC ATGAACTCAT CCAAGTGATG GCTGAACTGT CGCCAGCAGC TAAAACAGGG AAGCGAAAAA GGAGTCAGAT GCTGTTTCGA GGTCGAAGAG CATCCCAGTA A-3BLAST比對(duì)顯示與GenBank中編碼人干擾素 cDNA序列一致。2.3 pQE80L-huIFN經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳顯示在480bp和Kb各有一條帶，證明pQE80L/huIFN重組質(zhì)粒已經(jīng)被成功構(gòu)建。蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) pQE80L/huIFN質(zhì)粒的DH5菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)了目的蛋白，并以包涵體形式存在。2.5 蛋白的鑒定 Western blot分析顯示,經(jīng)誘導(dǎo)的菌體裂解物與抗His單抗反應(yīng),在分子量約17KD處出現(xiàn)單一條帶,而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體則無(wú)此反應(yīng),說(shuō)明融合有6His目的蛋白得到表達(dá)，見圖2（略）。2.6蛋白的純化及檢測(cè) 蛋白經(jīng)表達(dá)、提取和Ni2 +-NTA純化后行SDS-PAGE,結(jié)果電泳譜中呈單一條帶,說(shuō)明目的蛋白具有較高純度，見圖3（略）；雙抗夾心ELISA法檢測(cè)出huIFN。3 討論 干擾素又稱免疫干擾素, 巨噬細(xì)胞激活因子等,具有抗腫瘤、抗病毒和調(diào)節(jié)細(xì)胞分化等作用3，4。干擾素主要由T細(xì)胞和NK細(xì)胞在抗原或細(xì)胞