東亞鉗蝎鈣通道樣毒素的克隆與其在大腸桿菌中的表達(dá)

1、第34卷第1期2006年2月廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)ACADEMICJOURNALOFGUANGZHOUMEDICALCOLLEGE論著東亞鉗蝎鈣通道樣毒素的克隆與其在大腸桿菌中的表達(dá)覃 媛 顧少菊 孔天翰*(廣州醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所,廣東廣州510182)摘要 目的:克隆東亞鉗蝎鈣通道樣毒素(BmCa)基因,并構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒,在大腸桿菌中重組表達(dá)該毒素蛋白。方法:以東亞鉗蝎尾毒腺的總RNA為模板,通過RT PCR技術(shù),擴(kuò)增并克隆BmCa的cDNA基因,并將該基因重組到PET GST表達(dá)載體中,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21并誘導(dǎo)表達(dá),采用Ni SuperChelatingResin柱親和層析純化,用小白鼠毒性實(shí)

2、驗(yàn)檢測融合蛋白的活性。結(jié)果:成功克隆BmCa基因并構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒,IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)分子質(zhì)量約為33KD的融合蛋白,含量為大腸桿菌總蛋白的25%,經(jīng)親和層析得較高純度的融合蛋白,小白鼠毒性實(shí)驗(yàn)表明融合蛋白具有活性。結(jié)論:在大腸桿菌中成功表達(dá)了有活性的東亞鉗蝎鈣通道樣毒素蛋白,為其功能研究奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞 東亞鉗蝎;鈣通道毒素;融合表達(dá)中圖分類號 Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1008-1836(2006)01-0005-04CloningandExpressionofCaChannelToxin likeScorpionVenomfromButhusMartensiiKarschinE

3、scherichiacoliQINYuan,GUShao ju,KONGTian han(InstituteofSnakeVenom,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510182,China)AbstractObjective:TocloneandreconstructaprokaryoticexpressionplasmidofCa2+channeltoxin like2+scorpionvenomfromButhusmartensiiKarsch(BmCa)gene,andexpressthevenomproteininE.coli.Methods:The

4、cDNAofBmCawasobtainedbymeansofRT PCRfromthetotalRNAofthevenomgland.ThePCRproductwasexpressedinE.coliBL21(DE3)usingaPET GSTexpressionsystem.ThefusionproteinwaspurifiedbyNi SuperChelatingResin.Acutetoxicityassayinmicewasusedasthemethodtodetectthebiologicalactivityoffusionprotein.Results:TheBmCagenewas

5、clonedandtheexpressionplasmidreconstructed.WithIPTGinduction,the33KDfusionproteinwasefficientlyexpressedaggregatinguptomorethan25%oftotalbacterialprotein.Afterinjectionofpurifiedfusionprotein,themiceshowedneurotoxicsymptoms.Conclusion:WesuccessfullyexpressedBmCainE.coliandobtainedbiologicallyactivep

6、rotein.Keywords ButhusmartensiiKarsch;Ca2+channeltoxin;fusedexpression蝎毒素是蝎毒中主要的活性多肽,近年來隨著其在多種離子通道方面的生物學(xué)功能被認(rèn)知,已成為科學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)13等腫瘤細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高,推測抗癌多肽可能通過升高腫瘤細(xì)胞內(nèi)CaI啟動腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡究極少5-742+。離子通道在人體細(xì)。我國對東亞鉗蝎的研胞的癌變過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用,是許多藥物作用的重要靶點(diǎn)。以往本研究對東亞鉗蝎毒抗腫瘤機(jī)制的研究中,觀察到蝎毒抗癌多肽可引起胃黏液腺癌MGC 803、人乳腺髓樣癌BCap 37、肺癌A5

7、49基金項(xiàng)目:廣東省科技攻關(guān)課題(2003A3080302);廣東省科技廳課題(粵科基辦(2005)04號-5002714);廣州醫(yī)學(xué)院課題(04 K 49)作者簡介:覃媛(1978.2-),女,碩士。研究方向:生物毒素藥理。*通訊作者E-mai:lKongth.究多集中在鈉、鉀、氯通道毒素,對鈣通道毒素的研。由于天然純蝎毒多肽獲得比較困難,隨著生物技術(shù)的發(fā)展,克隆并重組蝎毒素基因,可以獲得大量高純度的重組蝎毒素蛋白,為更深入的研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。我們從基因庫中找到一個(gè)推測為東亞鉗蝎鈣通道毒素基因,未見對其蛋白及功能的研究。本研究首次對該基因進(jìn)行了表達(dá),得到較高純度

8、的融合蛋白,并對其生物活性作了初步測定。廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)(JGZMC) 2006,34(1)1 材料與方法1.1 材料東亞鉗蝎由河南華翰蝎養(yǎng)殖場提供,RT PCR試劑盒購自北京賽百勝公司,PGEM T載體,表達(dá)載體PET GST由本院中心實(shí)驗(yàn)室保存,酶及DNAMarker購自Takara公司,蛋白質(zhì)Marker購于英韋創(chuàng)津公司,PCR引物由上海英駿公司合成,Ni SuperChelatingResin柱購于瑞典Pharmacia公司。1.2 方法1.2.1 東亞鉗蝎鈣通毒素基因的克隆 查閱蝎毒鈣通道調(diào)節(jié)蛋白基因和氨基酸序列,設(shè)計(jì)并合成引物:上引物5 GGATCCTTTTTGCTTCTCACAGC

9、TATT;下引物5 GCTAGCTGGACCAAAATCTGGTCT。東亞鉗蝎電刺激(10V)排毒24h后,切下尾部毒腺,液氮捻磨,Trizole法提取其總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以提取的總RNA為模板,采用RT PCR一步法擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:42!,60min(反轉(zhuǎn)錄cDNA);94!,5min(反轉(zhuǎn)錄酶失活);94!,1min;60!,2min;72!,3min;共進(jìn)行30個(gè)循環(huán),94!,1min;58!,2min;72!,10min。產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳分析。擴(kuò)增產(chǎn)物用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收,直接與克隆載體pGEM T進(jìn)行連接,連接子pGEM T BmCa轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)

10、TOP10細(xì)胞,在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選初步鑒定為陽性的菌落進(jìn)行質(zhì)粒的抽提,送測序。1.2.2 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與其在大腸桿菌中的表達(dá) 用BamHI、NheI雙酶切pGEM T BmCa,純化后連結(jié)于用同樣兩種酶切的PET GST表達(dá)載體中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10細(xì)胞,在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選出陽性克隆,酶切鑒定并測序。將正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21,37!培養(yǎng)至A600=0.51.0、用終濃度為1GGATCCmmol/LIPTG、30!誘導(dǎo)表達(dá),SDS PAGE電泳檢測表達(dá)蛋白。優(yōu)化表達(dá)條件,選用高效表達(dá)菌株大量表達(dá)。1.2.3 包涵體的變性、復(fù)性、純化

11、 將誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌冰浴超聲破碎,離心沉淀用1%TritonX 100洗滌后,采用8mol/L尿素(含10mmol/LDTT)溶解GST rBmCa包涵體,利用融合蛋白上的6His能與多種金屬螯合物結(jié)合的特性,采用Ni SuperChelatingResin柱親和層析純化融合蛋白。采用尿素梯度透析,將純化的融合蛋白調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度至100 g/mL,對復(fù)性液(20mmol/LTris C,l6mol/L尿素,0.1mol/LNaC,l1mmol/LGSH,1mmol/LGSSG,pH8.0)透析,逐漸降低尿素濃度分別為4、2、1mol/L,最后轉(zhuǎn)入20mmol/LPBS中,離心取上清。1.2.4

12、 重組蛋白的活性分析 采用小白鼠毒性實(shí)驗(yàn),將12只小白鼠分兩組,一組腹腔注射5mg/kg復(fù)性后的融合蛋白,另一組注射同樣處理的不含BmCa基因的表達(dá)載體的誘導(dǎo)蛋白作為對照。觀察記錄其中毒現(xiàn)象。2 結(jié) 果2.1 東亞鉗蝎鈣通毒素基因的克隆與序列分析Trizole法提取的蝎尾腺總RNA,電泳檢測可見28S、18S和5S三條帶,說明RNA無明顯降解。以總RNA為模板,RT PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果見圖2,檢測于180bp處可見一清晰條帶,說明得到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物連入pGEM T載體后,得到重組質(zhì)粒pGEM T BmCa,該質(zhì)粒用BamHI、NheI雙酶切,重新得到與PCR大小相似的片段。證明

13、PCR產(chǎn)物得以克隆。為進(jìn)一步鑒定陽性重組質(zhì)粒中插入的BmCa序列,采用Sanger雙脫氧終止法進(jìn)行序列測定,序列測定結(jié)果表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物閱讀框架正確,BmCa基因的核苷酸序列及由此導(dǎo)出的氨基酸序列見圖1。ACTTTACTTTTTGCTTCTCACAGCTATTTTATGCCATGCTGAACATGCATTAGATGAAFLLLTAILCHAEHALDEGCAAGAGGTTGCAATCGTTTAAATAAAAAATGTAATTCGGATGGAGACTGTTGCAGAARGCNRLNKKCNSDGDCCRYGGTGAGAGATGCATCAGCACTGGAGTTAATTATTATTGTAGACCA

14、GATTTTGGTCCAGCTAGCGERCISTGVNYYCRPDFGP圖1 BmCa基因的核苷酸序列及由此導(dǎo)出的氨基酸序列Fig.1 ThenucleotidesequenceofBmCaandthededucedaminoacidsequence2.3 重組蛋白的變性、復(fù)性、純化經(jīng)SDS PAGE發(fā)現(xiàn)表達(dá)的目的蛋白主要以包涵體形式存在,經(jīng)變性、復(fù)性后包涵體溶解為可溶蛋白。經(jīng)Ni SuperChelatingResin柱親和層析純化,純化后的表達(dá)產(chǎn)物基本為單一組分(見圖5)。圖2 BmCa基因RT PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 AgarosegelelectrophoresisofRT PCR

15、M:DNAmarker1002000bp1:BmCaDNA圖5 純化的融合蛋白的SDS PAGE電泳分析Fig.5 TheSDS PAGEanalysisofpurifiedfusionproteinM:Proteinmarker1:purifiedfusionprotein2:unpurifiedfusionprotein2.4 重組蛋白活性分析取融合蛋白由腹腔注射小白鼠,約1h后,表現(xiàn)圖3 pGEM T BmCa質(zhì)粒酶切電泳Fig.3 TherestrictionendonucleasedigestionofpGEM TBmCa1:pGEM T BmCaM:DNAmarker1002000

16、bp出腹部緊縮、呆滯、后肢強(qiáng)直、肌肉震顫、對外界刺激反應(yīng)遲鈍等中毒現(xiàn)象,而對照組無異常反應(yīng),表明表達(dá)的融合蛋白具有生物學(xué)活性。2.2 東亞鉗蝎鈣通毒素表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與其在大腸桿菌中的表達(dá)質(zhì)粒pGEM T BmCa經(jīng)雙酶切后,克隆至同樣酶切的PET GST表達(dá)載體中,構(gòu)建出正確的重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。將轉(zhuǎn)化子接種到含Amp的LB培養(yǎng)液中,IPTG誘導(dǎo)1h后在細(xì)胞內(nèi)開始表達(dá)融合蛋白,4h表達(dá)量最大。SDS PAGE凝膠電泳(見圖4),結(jié)果顯示融合蛋白分子量為33kD,與預(yù)計(jì)分子量吻合。3 討 論本課題通過RT PCR技術(shù)克隆得到東亞鉗蝎鈣通道毒素基因BmCa,該基因編碼57個(gè)

17、氨基酸,含有3對二硫鍵。目前國外從不同種屬蝎毒中得到約幾個(gè)Ca通道的毒素,以來源于Pandinusimperator的IpTxA,和來自Scorpionmauruspalmatus的Maurocal cine(Mca)為代表,它們多是Ca通道軟諾丁受體(RyR)的激動劑,以劑量依賴的方式誘導(dǎo)Ca由肌漿網(wǎng)鈣庫中釋放2+892+2+2+。該多肽與其它種屬的蝎毒中得到的Ca通道毒素同源性不高,但Cys排列基本相同,推測它們存在相同的二硫鍵排列方式。為研究該多肽的生物學(xué)功能,本研究采用大腸桿菌PET GST表達(dá)載體對其進(jìn)行表達(dá)。PET GST表達(dá)載體采用T7啟動子和GST融合表達(dá),C端還添加了6個(gè)Hi

18、s。本研究利用該載體成功高效表達(dá)了該鈣通道M:Proteinmarker 2:PET GST 3:fusionprotein毒素的融合蛋白,表達(dá)產(chǎn)物約占菌體總蛋白的25%,本研究利用6HisTag能與金屬離子螯合物結(jié)合的特性,采用Ni SuperChelatingResin柱親和層析可快速獲得純度較高的融合蛋白。并可進(jìn)一步利廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)(JGZMC) 2006,34(1)用蛋白酶去除融合部分,得到重組鈣通道毒素蛋白。由于天然純蝎毒素蛋白獲得比較困難,因此利用基因工程手段進(jìn)行蝎毒素的表達(dá)研究具有重要意義。本研究構(gòu)建多種原核與真核重組表達(dá)質(zhì)粒,以期獲得最優(yōu)表達(dá)體系,為蝎毒素基因工程產(chǎn)品的開發(fā)奠定

19、基礎(chǔ)。目前重組蝎毒素基因表達(dá)的關(guān)鍵問題仍是如何獲得有活性的重組蛋白。本研究采用梯度透析的方法逐步降低尿素濃度,并在透析液中加入11的GSH/GSSG氧化還原體系促使二硫鍵形成,使變性的蛋白得以復(fù)性。將復(fù)性后的重組蛋白注入小白鼠體內(nèi),小鼠出現(xiàn)相應(yīng)的中毒現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用大腸桿菌重組表達(dá)東亞鉗蝎鈣通道毒素融合蛋白具有生物學(xué)活性。胞漿內(nèi)的游離鈣作為偶聯(lián)外刺激和細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的第二信使,廣泛參與、調(diào)節(jié)多種生理和病理過程。Ca作為多個(gè)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的樞紐存在著多條誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑,對細(xì)胞凋亡的研究發(fā)現(xiàn),胞內(nèi)游離Ca離子水平的持續(xù)升高是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要原因。本課題今后將進(jìn)一步對這個(gè)鈣通道毒素的功能及藥理

20、、生理特性做深入的研究,以期為東亞鉗蝎毒抗腫瘤研究提供理論基礎(chǔ),并為蝎毒素基因工程產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)diumchannelinexcitablemembranesJ.PharmacolToxico,l1980,20(4):15-43.insspecificforNa+ channelsJ.EurJBiochem,1999,AnnuRev2+2+264(2):287-300.RyanodinereceptorCa2+releasechannelofsarcoplasmicreticulumbyanoveiscorpionvenomJ.JBiolChem,1991,266(29):19135-19138.4孔天翰,林 山,韓雪飛,等.蝎毒抗癌多肽對腫瘤細(xì)胞的抑制作用的