qPCR實(shí)驗(yàn)操作流程

1、Q-P CR實(shí)驗(yàn)流程、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備，每天早上到實(shí)驗(yàn)室后，先把超凈工作臺(tái)的紫外燈打開(kāi)15-20分鐘。超凈臺(tái)前做實(shí)驗(yàn)，需佩戴干凈的橡膠手套 / 一次性 薄膜手套，RNA抽提需帶口罩。取EP管/槍頭時(shí)需用鑷子，不可以用使用過(guò)的手套直接取用。取完 EP管/槍頭后，袋子及時(shí)封好。橡 膠手套須放入超凈臺(tái)照射紫外，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中不得帶出超凈臺(tái)，移液器在一天工作結(jié)束后調(diào)至最大量程，并用75聽(tīng)醇清潔移液器，槍 頭盒及超凈臺(tái)面。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的過(guò)程中或觀看實(shí)驗(yàn)時(shí)，沒(méi)有帶口罩不 要在超凈臺(tái)前講話。、總RNAtt提1）細(xì)胞培養(yǎng)皿中細(xì)胞樣品用1*PBS洗兩次后，用1ml槍將PBS吸干凈,加入1ml Trizol（In vitr

2、oge n ）溶液，吹打混勻，并吸至 1.5ml RNasefree EP管中使細(xì)胞充分裂解，室溫靜置 5min；組織樣品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol（In vitroge n ）溶液,混勻，室溫放置5min使其充分裂解；（管蓋與管壁都需標(biāo)記樣品名稱）2）加入200卩l(xiāng)氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機(jī)相充分接觸，室溫靜置 3-5min ；（離心時(shí)離心管按順序排放，離心完畢，離心管的順 序也按順序排好，與第一步的順序一致）3） 4 C下，14,000g離心15min,可見(jiàn)分為三層，RNA在上層水相，移至另一個(gè)新的RNase free EP管；（用20-200ul的槍吸取上清，吸

3、上清時(shí), 槍頭應(yīng)沿著液面上層吸取上清，槍頭不可碰到、吸到中間層） 4）沉淀RNA加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒 6-8次）（不應(yīng)用振蕩器混勻），室溫靜置 10mi n；5） 4C下，14,000g離心10min,收集RNA沉淀（如離心后仍不見(jiàn)EP管底 部有沉淀，應(yīng)將EP管放置在-80度冰箱過(guò)夜，繼續(xù)在4C下，14,000g離心10min，收集RNA沉淀），去上清:6）用75%乙醇洗滌兩次（12,000g離心5min）（加入乙醇后只需輕輕顛倒EP管即可，不用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀），超凈臺(tái)風(fēng)干：沉淀不 能過(guò)干或過(guò)濕，過(guò)干則不易溶解，過(guò)濕則乙醇?xì)埩簟?）視沉淀量加入適量DEPC水（至少1

4、5ul）溶解沉淀。三、去基因組使用RNase-free的DNase ? （Promega，按以下體系配置反應(yīng)液,37 r 消化 30min, 65 C 滅活 10min。RNA30卩1DNase ?20卩110 x buffer10卩1H2O(RNase free)39.卩1RNasi n5卩10.5總體積100卩1然后按以下步驟操作:1)加入等體積的苯酚/氯仿，上下顛倒混勻，室溫放置 5min，后2)14,000rpm，離心 15mi n，取上清。加入等體積的氯仿，上下顛倒混勻，靜置分層后14,000rpm，離心3)15mi n,取上清。加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒6-8次）,20

5、 r靜置15min；4)5)4C下，14,000g離心15min,收集RNA沉淀，去上清； 用75%乙醇洗滌兩次（12,000g離心5min）,超凈臺(tái)風(fēng)干;6)加入適量DEPC水（至少15ul ）溶解沉淀。四、總RNA純度和完整性檢測(cè) 1）純度檢測(cè)：取1卩I RNA樣品50倍稀釋，在核酸蛋白檢測(cè)儀上測(cè)定 OD值,OD6Q/OD80的比值大于1.8，說(shuō)明制備的RNA較純，無(wú)蛋白質(zhì)污染。2）總RNA完整性檢測(cè)：取RNA樣品1卩l(xiāng) , 1%瓊脂糖凝膠電泳80VX 20min, EB染色10min,用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，總 RNA勺5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA條帶，三條條帶完

6、整的話即可證明總 RNA抽提比較完整。五、逆轉(zhuǎn)錄1. mRNA 1）在RNase free的PCR管中配置下列溶液.2)將上述溶液吹打均勻，置85 C3)保溫 5min，使立即冰上致冷,性;Total RNAH2O1.0RNA變性。隨后以防止RNA復(fù)總體積在該P(yáng)CR管中加入下列試劑（Promega4)將上述20卩I反應(yīng)溶液30r保溫10min；5)42r保溫 50min；6)85 r 保溫 10mi n；7)-20 r保存。oligo (dT)0.5卩l(xiāng)Ran dom p rimer0.5卩l(xiāng)10mM dNT P2.0卩l(xiāng)RNase in hibitor0.5卩l(xiāng)5 x buffer4.0卩l(xiāng)

7、M-MLV0.5卩l(xiāng)總體積8.0卩l(xiāng)3)2. microRNA :使用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄法，原理如下圖:1)在去RNase的 PCRf中配置以下溶液.2)將上述溶液混勻，total RNA85 r孵X個(gè)miR逆轉(zhuǎn)錄引物打開(kāi)RNAH01.00.5*X育5min,以隨后立總體積12.5卩l(xiāng)即置于冰上，以防止RNA復(fù)性再次恢復(fù)二級(jí)結(jié)構(gòu)；在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：10mM dNT P (p romega)2.0卩l(xiāng)RNase in hibitor (pro mega)0.5卩l(xiāng)U6逆轉(zhuǎn)錄引物0.5卩l(xiāng)5x buffer4.0卩l(xiāng)M-MLV (p romega)0.5卩l(xiāng)二級(jí)結(jié)構(gòu)。4)5)42

8、r 孵育 50min；6)85r孵育10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。7.5總體積將3)溶液加入到1)溶液中，混勻后30C保溫10min；四、定量PCR僉測(cè)1. 引物測(cè)試:根據(jù)mRN般計(jì)的引物正式實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行qPCR測(cè)試其特異性和擴(kuò)增效率，具 體反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如正式實(shí)驗(yàn)，每對(duì)引物需做模板水對(duì)照。得到結(jié)果后，首先根據(jù)熔解曲線判斷引物特異性， 選擇標(biāo)準(zhǔn)為：?jiǎn)畏迩曳逍?偏窄、水對(duì)照無(wú)明顯引物二聚體熔解曲線峰。 若設(shè)計(jì)的多對(duì)引物熔解曲線均顯示特異性良好，則應(yīng)對(duì)比各引物的擴(kuò)增曲線，優(yōu)先選擇Ct值小、擴(kuò)增效率高的引 物進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。(1) 一個(gè)樣2. 確定上機(jī)內(nèi)容后，首先在記錄本上編排好上機(jī)的樣品排放順序。品的

9、加樣盡可能安排在同一行(2)如正式實(shí)驗(yàn)中三次重復(fù)不能安排在同一板上,則需把三次重復(fù)中的實(shí)驗(yàn)分開(kāi),但同一次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)不能分開(kāi)兩板3. 正式實(shí)驗(yàn):體系配制:4ulH20SYBR Green PCR Master Mix10ul(TOYOBO)(使用前需振蕩均勻)上游引物0.5ul(10uM下游引物0.5ul(10uM15ul總體積計(jì)算好實(shí)驗(yàn)中需用多少份體系，則按具體量配置。體系分裝會(huì)有損失, 般多配0.5份-1份體系。總的體系配好后，在振蕩器中振蕩均勻或用槍吸打均勻， 然后15ul每管分 裝至8連管中。3. cDNA用滅菌純水稀釋適當(dāng)?shù)臐舛?，一般?1:20稀釋，如遇到基因表達(dá)低的 樣品，則適當(dāng)降

10、低稀釋比例至1:10或1:5。 cDNA按一定順序排好后，即可加至 剛配好的反應(yīng)體系中。加樣完畢，蓋好八連管蓋，并在八連管蓋最上沿的邊上標(biāo) 記好1-12的順序(不可將標(biāo)記寫(xiě)在反應(yīng)管的蓋子上，八連管蓋避免裸手觸摸中間透明的熒光采集區(qū)域， 且保證每孔均蓋緊， 否則影響重復(fù)性或可能出現(xiàn)熔解曲 線峰漂移。）4把各排八連管放在掌上離心機(jī)上離心數(shù)秒。上機(jī)：五5.15.25.3先開(kāi)電腦，進(jìn)入 Windows界面。接著打開(kāi)PCF儀電源開(kāi)關(guān)。打開(kāi)7500軟件，選擇“新建”，在“ Temp late ”下拉菜單中選擇“ 60”或位，剔除無(wú)反應(yīng)管的孔位?！?5” （普通基因檢測(cè)為“ 60”，MicroRNA檢測(cè)為“ 65”） 打開(kāi)樣品架，放入八連管，關(guān)上樣品架，并在軟件上選擇已放反應(yīng)管的孔5.4點(diǎn)擊File菜單中Save,輸入要保存結(jié)果的文件名，命名為日期-上機(jī)時(shí)間5.5-客戶名字簡(jiǎn)寫(xiě)，如100830-1008-WL表示8月30日10點(diǎn)08分魏立的實(shí)驗(yàn)。點(diǎn)擊 Start 鍵，開(kāi)始運(yùn)行程序。5.65.7程序運(yùn)行完畢