年產(chǎn)6000噸木聚糖酶發(fā)酵車間的設(shè)計

1、年產(chǎn)6000噸木聚糖酶發(fā)酵車間的設(shè)計 作 者 姓 名 李斌 專 業(yè) 生物技術(shù)及應(yīng)用 指導(dǎo)教師姓名 張大偉 目 錄摘 要 1ABSTRACT 2 第一章 緒論 31.1木聚糖酶簡介 31.1.1木聚糖酶的理化性質(zhì) 31.1.2木聚糖酶的生產(chǎn)簡史 41.1.3木聚糖酶用途 41.1.4木聚糖酶產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀 51.2巴斯德畢赤酵母簡介 61.2.1巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng) 61.2.2巴斯德畢赤酵母的優(yōu)缺點 61.2.3前景展望 7 第二章 木聚糖酶發(fā)酵機理72.1重組巴斯德畢赤酵母發(fā)酵合成木聚糖酶的代謝途徑 72.1.1甘油代謝途徑 7 2.1.2甲醇代謝途徑92.2巴斯德畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶過

2、程中的主要影響因素 112.2.1碳源的影響112.2.2氮源的影響112.2.3基礎(chǔ)鹽和PTM1微量鹽的影響 112.2.4添加其它物質(zhì),降低蛋白酶降解122.2.5pH的影響122.2.6溫度的影響122.2.7溶氧濃度(DO )的影響 132.2.8誘導(dǎo)前菌體密度( CWPT I )與比生長速率(PT I )的影響13 第三章 木聚糖酶發(fā)酵的工藝流程 133.1高效分泌木聚糖酶的畢赤酵母工程菌株的獲得133.1.1材料 133.1.2黑曲霉木聚糖酶cDNA 的獲得 133.1.3表達載體VMANpPIC9K 的構(gòu)建 133.1.4重組菌株VMANpPIC9KGS115 的獲得和高酶活菌株

3、的篩選133.1.5重組畢赤酵母的擴大培養(yǎng) 133.2重組巴斯德畢赤酵母工程菌發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶 143.2.1原料 143.2.2重組菌株的液體發(fā)酵 153.2.3發(fā)酵工序 153.3發(fā)酵液后處理獲得木聚糖酶 163.3.1離心 163.3.2干燥 173.4工藝流程 173.5產(chǎn)品的工藝要求 183.5.1產(chǎn)品的規(guī)格與使用方法 183.5.2產(chǎn)品的包裝與儲運 183.5.3常用飼料原料中木聚糖量 18 第四章 工藝計算 194.1物料衡算 194.1.1原料的物料衡算194.2熱量衡算204.3冷卻水水耗20 第五章 設(shè)備的設(shè)計與選型215.1輸送設(shè)備的設(shè)計計算 215.2發(fā)酵設(shè)備的設(shè)計及選

4、型235.2.1發(fā)酵罐的設(shè)計計算235.2.2種子罐的設(shè)計265.3發(fā)酵車間相關(guān)設(shè)備的型號一覽表 26 第六章 發(fā)酵車間的布置設(shè)計 29 6.1概述296.2生產(chǎn)車間工藝布置的原則296.2.1車間布置設(shè)計的依據(jù)296.2.2生產(chǎn)車間工藝布置的原則306.3發(fā)酵車間的設(shè)計316.4管路的設(shè)計32 第七章 總平面布置與建筑說明337.1設(shè)計依據(jù)和范圍337.1.1設(shè)計依據(jù)337.2廠址337.2.1廠址地理位置337.2.2廠區(qū)基本條件337.3總廠平面設(shè)計337.3.1平面設(shè)計原則347.3.2平面的總體布置的設(shè)計方案347.3.3工廠出入口布置特征357.3.4廠區(qū)設(shè)計357.3.5坐標系統(tǒng)

5、357.3.6廠區(qū)劃分要求357.4建筑物得布置位置36參考文獻37致謝38摘 要木聚糖酶(-1,4-D-Xylanase, EC3.2.1.78)是一類能夠水解-1,4-糖苷鍵的半纖維素酶，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、造紙、采油等諸多領(lǐng)域。本設(shè)計以一株高效表達木聚糖酶的重組畢赤酵母為發(fā)酵菌株,對年產(chǎn)6000噸木聚糖酶的發(fā)酵車間進行設(shè)計。發(fā)酵工藝采用連續(xù)補料培養(yǎng)工藝，選用2個0.8m3一級種子罐和2個8 m3二級種子罐，采用2個80m3發(fā)酵罐，發(fā)酵罐直徑3100 mm。發(fā)酵罐罐體厚度設(shè)計是6.5mm，制作材料采用1Cr18Ni9Ti耐酸不銹鋼。本設(shè)計根據(jù)確定的工藝流程進行了物料衡算，并繪制了

6、全廠工藝流程圖、全廠總平面布置圖及三級發(fā)酵罐的裝配圖。關(guān)鍵詞：木聚糖酶 高密度發(fā)酵 補料培養(yǎng) 發(fā)酵罐 ABSTRACTxylanase (-1 ,4-D-xylanase , EC3.2.1.78) are a class can hydrolyze -1 ,4-glycosidic bond hemicellulase, its role in xylan substrate grapes , xylan, galactoxylan and galactoxylan such as grape xylan more widely distributed in nature, most are

7、 renewable resources. hemicellulose resources as the major products of deep processing, -xylanase has been widely applied In food, medicine, feed, paper, oil and many other fields.In this study, using RT-PCR, selection was highly expressed xylanase secreted Pichia pastoris strain MAN22, and the liqu

8、id fermentation. Temperature control during fermentation 30 ° C, by adjusting the stirring rate to the dissolved oxygen concentration was maintained at 30%, mainly in methanol as carbon source, nitrogen source, ammonia did, by adding ammonia flow control pH 5.5, make every 12 h Add a Methanol,

9、post-fermentation to add 5% (NH4) 2 SO4, NH4 + levels were maintained to 150mmol / L or more (2 g / L or so). Seeds with two 0.6m3 and two 6 m3 tank and two second seed containers, with two 60m3 fermenter, the fermentation tank diameter of 3100m. Fermentation Tanks thickness design is 6.5mm, made of

10、 stainless steel materials used 1Cr18Ni9Ti acid. Selected according to the design of -xylanase production process and the design of computing devices, according to the requirements of the mission statement drawn flow chart of the whole plant, whole plant general layout plans and -xylanase fermentati

11、on tank assembly Fig.朗讀顯示對應(yīng)的拉丁字符的拼音 字典Key words: xylanase ; High density fermentation; seed pot; fermentation pot 第一章 緒論1.1木聚糖酶簡介1.1.1木聚糖酶的理化性質(zhì) 木聚糖酶（Xylanase）EC 3.2.1.8是指將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一組酶的總稱，是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶。主要包括外切ß-1，4-木聚糖酶，內(nèi)切ß-1，4-木聚糖酶和ß-木糖苷酶。其中外切ß-1，4-木聚糖酶EC3.2.1.92是以單個木糖為切

12、割單位，它作用于木聚糖的非還原性末端，使反應(yīng)體系的還原性不斷增加。內(nèi)切ß-1，4-木聚糖酶EC3.2.1.8是從木聚糖主鏈的內(nèi)部切割ß-1，4糖苷鍵，使木聚糖溶液的黏度迅速降低，鑒于其特殊功能，內(nèi)切ß-1，4-木聚糖酶多用于食品行業(yè)。ß-木糖苷酶EC3.2.1.37主要作用是切割低聚木糖和木二糖，有助于木聚糖徹底降解為木糖。該酶通過水解低聚木糖的末端來催化釋放木糖殘基。 不同來源的木聚糖酶在組成和催化性質(zhì)上各不相同，但它們的理化性質(zhì)有相似的地方。大多數(shù)微生物木聚糖酶為單亞基蛋白，分子量8145kDa，等電點pI值310，最適作用溫度為4075。根據(jù)對幾十

13、種內(nèi)切ß-1，4-木聚糖酶的分子量和等電點進行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，70%的酸性ß-1，4-木聚糖酶分子量在30kDa以上，而堿性ß-1，4-木聚糖酶分子量則多在30kDa以下。木聚糖酶 中ß-木糖苷酶有單聚體、二聚體或四聚體等組成形式，分子量為26360kDa，pI值為3.37.3。其它一些特異性酶，如-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶多以單體形式存在，也有二聚體、四聚體、六聚體和八聚體等形式，分子量為53495kDa，pI值為2.59.3 ；-葡萄糖醛酸苷酶的分子量一般都大于100kDa，而pI值都小于4.0。粘度：木聚糖酶在水中溶解后變成有粘性的溶液，使消化道中食

14、糜的粘稠度增加。木聚糖在低溶度時，因與水分子直接互作而增加了食糜的粘度。隨著木聚糖溶度的增加，分子本身相互作用，從而纏繞成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種作用過程的相互作用極大時，可能會變成凝膠。表面活性：木聚糖的表面帶有負電荷，在溶液中趨于與其他物質(zhì)表面結(jié)合。在飼料消化時，多糖可以與腸道中的飼料顆粒表面、脂類微團表面及多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物表面相結(jié)合。持水性：由于木聚糖具有高的持水性，這在木聚糖溶度較高時變得尤其顯著，因為此時可以形成凝膠。這些效應(yīng)能根本上改變消化物的物理特性，從而改變腸道的生理機能，即增強對腸蠕動的抵抗力。離子、小分子與木聚糖的結(jié)合：除了陽離子與一些木聚糖中帶負電基團結(jié)合外，木聚糖的立體結(jié)構(gòu)也使

15、它與離子發(fā)生螯合作用事實上，陽離子能在木聚糖分子間形成離子橋，這將大大影響其粘度和凝膠的形成特性。小分子通過疏水鍵的相互作用，也可能與多糖發(fā)生微弱的結(jié)合。1.1.2木聚糖生產(chǎn)簡史 木聚糖酶的研究始于20世紀60年代。目前國際上研究工作主要集中在對微生物木聚糖酶的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)機理研究，以及酶的提純、鑒定方法，木聚糖酶基因分子的克隆和表達 等。而我國對木聚糖酶的研究主要集中在產(chǎn)木聚糖酶優(yōu)良菌株的篩選和馴化、木聚糖酶的純化和理化性質(zhì)的研究等方面。當前，木聚糖酶主要通過真菌、細菌等微生物發(fā)酵生產(chǎn)獲得。根據(jù)發(fā)酵工藝的不同，可分為固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種。這兩種發(fā)酵方式各有其優(yōu)缺點：固體發(fā)酵所用培養(yǎng)基相對便宜

16、，主要以農(nóng)副產(chǎn)品為主。且操作設(shè)備簡單，整個生產(chǎn)過程中無廢物產(chǎn)生，不存在環(huán)境污染問題，產(chǎn)率較高。易于在中、小企業(yè)推廣應(yīng)用，目前國內(nèi)木聚糖酶生產(chǎn)主要采用固體發(fā)酵方式。但固體發(fā)酵同時也存在不易控制，酶系復(fù)雜，纖維素等酶含量高，難以精酶化等缺點；相比較而言，液體發(fā)酵由于是在液態(tài)環(huán)境中進行，菌體、底物、產(chǎn)物（包括熱）均易于擴散，使得發(fā)酵能夠在均質(zhì)或擬均質(zhì)條件下進行。該方法便于在生產(chǎn)過程中進行實時檢測、控制，易于擴大生產(chǎn)規(guī)模。同時，由于液體輸送方便，便于機械化操作，產(chǎn)品也易于提取精制。液態(tài)發(fā)酵工藝的缺點主要是對設(shè)備有一定要求及生產(chǎn)成本較高，技術(shù)要求也較為嚴格。但隨著生物技術(shù)的發(fā)展和木聚糖酶廣泛應(yīng)用，采用液

17、體發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶將成為今后發(fā)展方向。1.1.3木聚糖酶的用途 從上世紀60年代開始，隨著木聚糖酶研究的不斷深入，其應(yīng)用領(lǐng)域也不斷擴大，在造紙、食品、飼料、紡織、醫(yī)藥、環(huán)境和能源等行業(yè)被廣泛應(yīng)用，前景十分看好。在造紙行業(yè)中的應(yīng)用：木聚糖酶在造紙工業(yè)中的重要作用體現(xiàn)在其取代了有毒化學物質(zhì)，通過酶法預(yù)處理可以回收造紙行業(yè)中有用的副產(chǎn)物等方面。造紙工業(yè)中通過木聚糖酶的使用，縮短了紙漿的處理時間，增加了纖維的分離度，使氯氣等化學漂白劑更好地滲透到紙漿里，從而大大減少了化學漂白劑的用量并且使漂白效果得以提高。木聚糖酶在造紙工業(yè)中還應(yīng)用于廢紙脫墨這一重要環(huán)節(jié)，不僅使脫墨工藝變得容易，而且減少了化學藥品的用

18、量。木聚糖酶應(yīng)用于紙漿生物漂白工藝過程，減少了氯氣用量，減少致癌物質(zhì)的排放，減輕環(huán)境污染，顯著改善了紙漿的濾過性、脆性，增加了纖維的分離度、紙漿漂白度，降低了生產(chǎn)能耗，降低了生產(chǎn)成本，其諸多優(yōu)點不斷在造紙工業(yè)中顯現(xiàn)出來。在食品行業(yè)中的應(yīng)用：木聚糖酶在食品行業(yè)中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在將天然半纖維素分解后得到低聚木糖這一環(huán)節(jié)。在面包的生產(chǎn)中，1/3的水分是面團中的戊聚糖吸收的，戊聚糖的高吸水性對面團和面包的質(zhì)量有明顯的影響。在新鮮蔬菜、水果加工成嬰兒食品、膏狀物、干燥蔬菜粉末和速溶食品時，營養(yǎng)物質(zhì)通常被一層堅硬的半纖維素、果膠等物質(zhì)組成的細胞壁所包圍，如果對其用含有纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶的酶制劑來處

19、理，就可在比較溫和條件下使組織柔化，使細胞破壁，將有效物質(zhì)充分提取出來。與此同時也降低了提取液的粘度，使生產(chǎn)過程中的濃縮、干燥效率成倍提高，相應(yīng)降低生產(chǎn)成本。其他應(yīng)用：據(jù)報道，木聚糖酶可與其它酶共同參與使植物降解為戊糖、己糖，再用其它菌株發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。也有報道發(fā)現(xiàn)能把植物纖維直接轉(zhuǎn)化為乙醇的一些菌，如Thermbacteroides acetoethylicus, Clotridium thermosaccharolyticum。另據(jù)報道，木聚糖酶在去污洗滌，醫(yī)藥制造，以及在果實成熟、種子萌發(fā)、真菌的寄生及植物的抗性等諸多生理過程中都有著重要的應(yīng)用。1.1.4木聚糖酶產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀我國對木聚糖酶

20、的研究主要集中在產(chǎn)木聚糖酶優(yōu)良菌株的篩選和馴化、木聚糖酶的純化和理化性質(zhì)的研究等方面。當前，木聚糖酶主要通過真菌、細菌等微生物發(fā)酵生產(chǎn)獲得。根據(jù)發(fā)酵工藝的不同，可分為固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種。這兩種發(fā)酵方式各有其優(yōu)缺點：固體發(fā)酵所用培養(yǎng)基相對便宜，主要以農(nóng)副產(chǎn)品為主。且操作設(shè)備簡單，整個生產(chǎn)過程中無廢物產(chǎn)生，不存在環(huán)境污染問題，產(chǎn)率較高。易于在中、小企業(yè)推廣應(yīng)用，目前國內(nèi)木聚糖酶生產(chǎn)主要采用固體發(fā)酵方式。但固體發(fā)酵同時也存在不易控制，酶系復(fù)雜，纖維素等酶含量高，難以精酶化等缺點；相比較而言，液體發(fā)酵由于是在液態(tài)環(huán)境中進行，菌體、底物、產(chǎn)物（包括熱）均易于擴散，使得發(fā)酵能夠在均質(zhì)或擬均質(zhì)條件下進行

21、。該方法便于在生產(chǎn)過程中進行實時檢測、控制，易于擴大生產(chǎn)規(guī)模。同時，由于液體輸送方便，便于機械化操作，產(chǎn)品也易于提取精制。液態(tài)發(fā)酵工藝的缺點主要是對設(shè)備有一定要求及生產(chǎn)成本較高，技術(shù)要求也較為嚴格。但隨著生物技術(shù)的發(fā)展和木聚糖酶廣泛應(yīng)用，采用液體發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶將成為今后發(fā)展方向。與國外相比，國內(nèi)在木聚糖酶方面的研究起步較晚，主要集中于海棗曲霉、黑曲霉、木霉菌、青霉菌等真核微生物和短小芽孢桿菌、串珠鏈孢菌、鏈霉菌、環(huán)狀芽孢桿菌、堿性假單胞菌等原核微生物木聚糖酶的研究。目前為止，國內(nèi)學者報道對木聚糖酶的研究基本上還僅限于對產(chǎn)木聚糖酶天然優(yōu)良菌株的篩選、酶的純化和一些酶學性質(zhì)研究方面，只克隆了少數(shù)

22、木聚糖酶基因27。由于木聚糖酶具有重要的應(yīng)用價值以及在生物工程技術(shù)的重要地位，現(xiàn)在己經(jīng)有越來越多的科研人員致力于木聚糖酶的開發(fā)研究，如高產(chǎn)菌株的選育、工程菌的構(gòu)建、優(yōu)化培養(yǎng)條件、無纖維素酶污染的木聚糖酶等。1.2巴斯德畢赤酵母簡介1.2.1巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng) 巴斯德畢赤酵母屬子囊菌類,為單倍體,由于在其細胞的過氧化物酶體中含有甲醇代謝途徑所必需的酶,如醇氧化酶(alcohol oxidase ,AOX) 、過氧化氫酶、二羥丙酮合成酶等 ,所以可利用甲醇作為唯一碳源和能源。由于巴斯德畢赤酵母能夠在簡單培養(yǎng)基上高密度發(fā)酵生長,所以它最初是作為一種工業(yè)的甲醇營養(yǎng)型酵母,主要用來生產(chǎn)單細胞蛋白質(zhì)。

23、 1.2.2巴斯德畢赤酵母的優(yōu)缺點 經(jīng)過二十多年的研究和應(yīng)用發(fā)現(xiàn),巴斯德畢赤酵母具有以下主要優(yōu)點:(1)具有醇氧化酶AOX1基因啟動子，這是目前最強，調(diào)控機理最嚴格的啟動子之一； (2)表達效率高,其表達的外源蛋白可占總表達蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分離純化； (3)在簡單合成培養(yǎng)基中可實現(xiàn)高密度培養(yǎng)； (4)表達質(zhì)粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合； (5)由于該酵母可以以甲醇為唯一碳源和能源,而絕大多數(shù)微生物并不能以甲醇為碳源,可以減少污染。它也具有以下缺點:(1)發(fā)酵周期長 (2)甲醇易燃易爆有毒，存在一定的危險性 (3)篩選高產(chǎn)菌株需用的藥物價格比較昂貴 (4

24、)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不成熟1.2.3前景展望巴斯德畢赤酵母是單細胞低等真核生物, 它既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作和高密度發(fā)酵等特性, 同時又具有適于真核生物基因產(chǎn)物正確折疊的細胞內(nèi)環(huán)境和糖鏈加工系統(tǒng), 還能分泌外源蛋白到培養(yǎng)液中, 利于純化。近幾十年來, 巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)發(fā)展成為一個較為理想的蛋白表達系統(tǒng)。它具有外源目的蛋白表達量高、基因遺傳穩(wěn)定和分泌效率高等優(yōu)點, 并具有甲醇精確調(diào)控的強啟動子醇氧化酶啟動子( PAOX )及日臻成熟的高密度發(fā)酵工藝, 是目前最優(yōu)秀、應(yīng)用最廣泛的外源基因表達系統(tǒng)之一, 越來越受到人們的重視, 被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于大量生產(chǎn)外源真核或其他結(jié)構(gòu)

25、較為復(fù)雜的原核蛋白。目前, 已經(jīng)有500多種外源蛋白在該系統(tǒng)中進行了高效表達。 第二章 木聚糖酶發(fā)酵機理2.1重組巴斯德畢赤酵母發(fā)酵合成木聚糖酶的代謝途徑 相對而言，對畢氏酵母的報道比較少且多為非結(jié)構(gòu)模型。由于非結(jié)構(gòu)模型多采用經(jīng)驗的 Monod 模型描述菌體發(fā)酵動力學，在表達菌體干重濃度和蛋白方面精度較差?？紤]到面包酵母和畢氏酵母在代謝行為和菌體形態(tài)多方面有很大的相似性，因此面包酵母的很多研究成果可以為畢氏酵母所借鑒。本章以 Bellgardt（1983）建立的面包酵母動力學模型為基礎(chǔ)，借鑒文獻所報道的甘油和甲醇的代謝途徑，對畢氏酵母發(fā)酵動力學建模。甘油的主要代謝途徑包括磷酸化、糖酵解、三羧酸

26、循環(huán)和呼吸鏈。在甲醇期，甲醇首先被氧化為甲醛，甲醛隨后進入分解代謝與合成代謝兩個途徑。在分解代謝中，甲醛被氧化為甲酸鹽和二氧化碳，并以電子NADH的形式釋放能量。合成代謝途徑與甘油期類似，也包括磷酸化、糖酵解和三羧酸循環(huán)等過程。2.1.1甘油代謝途徑 細胞外的甘油進入細胞內(nèi)部，首先被甘油激酶磷酸化為三磷酸甘油 G3P（Glycerol3-phosphate）。G3P 在三磷酸甘油脫氫酶的作用下被氧化為磷酸二羥丙酮。經(jīng)過糖酵解過程，磷酸二羥丙酮被分解成丙酮酸（PYR）。丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的作用下被氧化為乙酰輔酶 A（Acetyl-CoA）。通常在沒有任何反應(yīng)限制下，乙酰輔酶 A 直接進入三羧酸

27、循環(huán)（TCAcycle），在此過程中會有大量細胞物質(zhì)合成（如氨基酸、核酸等），同時伴隨電子載體（NADH）和能量（ATP）的轉(zhuǎn)換。在代謝過程中，如果溶氧或者丙酮酸脫羧反應(yīng)速率受到限制，代謝將會進入乙醇發(fā)酵途徑。此時，丙酮酸在丙酮酸脫羧酶的作用下生成乙醛（Acetaldehyde），乙醛在醇脫氫酶的作用下生成乙醇。而當上述限制解除后，乙醇又可作為基質(zhì)被利用，這時，乙醇首先被氧化為乙醛，乙醛進而被氧化為乙酸鹽，最后轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶 A 進入 TCA 循環(huán)。伴隨著甘油的代謝途徑，也有呼吸鏈的作用。呼吸鏈的主要作用是為細胞的生長和維持提供能量。關(guān)于甘油期內(nèi)細胞的合成代謝，在此假定細胞物質(zhì)小部分由 G3P

28、 轉(zhuǎn)化生成，其余大部分在 TCA 循環(huán)中生成。乙醇的生成和消耗過程見圖 2.1 中的點框，三羧酸循環(huán)和呼吸鏈分別見圖 2.1 中的虛線框。圖 2.1 給出了簡化的甘油在畢氏酵母細胞內(nèi)部代謝途徑。 圖2.1畢赤酵母甘油代謝途徑其中甘油轉(zhuǎn)化為三磷酸甘油： （2-1）G3P 的糖酵解方程（2-2）以及G3P 合成細胞物質(zhì)的方程（2-3）如下： （2-2） （2-3）視發(fā)酵罐內(nèi)溶氧水平或者丙酮酸脫羧反應(yīng)速率是否受到限制，丙酮酸可能直接進入三羧酸循環(huán)或者進入乙醇發(fā)酵支鏈。在我們的實驗中，溶氧濃度一直保持在 30以上，所以溶氧不受限；同時實時測量表明發(fā)酵罐內(nèi)乙醇濃度在 00.5 g l-1較低的范圍內(nèi)，為

29、此出于模型的簡化，本文忽略乙醇的發(fā)酵途徑，即去掉圖2.1中點框部分，認為丙酮酸直接進入三羧酸循環(huán)： （2-4） （2-5） (2-6)其中（2-5）是 TCA 循環(huán)的簡化方程，（2-6）描述了三羧酸循環(huán)過程中細胞物質(zhì)的生成。呼吸鏈中提供大量的能量轉(zhuǎn)換，見下式： （2-7）甘油代謝過程中產(chǎn)生的 ATP 一部分用于細胞生長過程的能量消耗，另一部分用于細胞自身生命的維持，甘油代謝過程中，細胞物質(zhì)主要在 G3P 糖酵解過程和三羧酸循環(huán)中合成。2.1.2甲醇代謝途徑圖 2.2 是簡化的甲醇期甲醇的代謝途徑，甲醇首先被醇氧化酶（AOX）氧化成甲醛和過氧化氫。甲醛隨后進入兩條代謝途徑，小部分進入分解代謝，大

30、部分進入合成代謝。在分解代謝中，甲醛首先被甲醛脫氫酶（FLD1p）氧化為甲酸鹽，并進一步被甲酸鹽脫氫酶（FDH）氧化為二氧化碳，同時以電子 NADH 的形式釋放能量，同時也避免了細胞內(nèi)部甲醇積累過多而產(chǎn)生毒害作用（Sibirny et al., 1990）。在合成代謝中，甲醛在二羥基丙酮合成酶的作用下與 5 磷木棉糖結(jié)合生成三磷酸甘油醛（GAP），GAP 隨后進入糖酵解和 TCA 循環(huán)。本文假定甲醇期的細胞物質(zhì)主要從 GAP 和 TCA 循環(huán)中轉(zhuǎn)化合成。消耗的甲醇進入分解代謝的比例為 。對于 的大小，文獻報道結(jié)論不一。Veenhuis et al.（1983）認為，甲醇代謝過程所需的能量主要來

31、自分解代謝，因此進入分解代謝途徑的甲醛較多；而 Sibirny et al.（1990）認為，分解代謝的作用主要是保護細胞不因大量的甲醇殘留而中毒的，代謝過程中需要的能量主要來自合成代謝，故進入合成代謝途徑的甲醛較多。由于碳源主要是在合成代謝途徑中消耗的，大量的能量應(yīng)來自于合成代謝。在本文的實驗中，甲醇期比生長速率的控制在較低水平（0.003-0.0085 h-1），甲醇的殘留濃度幾乎為零，因此不需要進行過多的分解代謝以避免較高濃度的甲醇殘留，故此本文 值設(shè)定在較低的0.25。不可否認， 的取值未必精確，還需要進一步的實驗結(jié)果來修正。幸運地是， 引起的誤差可以由模型中的其它參數(shù)來彌補。圖2.2

32、 畢赤酵母甲醇代謝途徑在此可以列出甲醇期的化學計量平衡方程：甲醇首先被氧化為甲醛： （2-8）甲醛在分解代謝中被氧化為甲酸欲，最終轉(zhuǎn)變?yōu)槎趸迹?(2-9)甲醛在合成代謝過程中被磷酸化。擊要指出的是，生成1摩爾的GAP擊要消耗3摩爾的甲醛(Lin Cereghino and Cregg, 2000: Lueers et al., 1998)。 （2-10）GAP酵解生成內(nèi)酮酸以及合成細胞物質(zhì)的方程分別見下式： （2-11） （2-12）內(nèi)酮酸被氧化為乙酞輔酶A甲醇期乙酞輔酶A以后的代謝途徑以及呼吸鏈中的代謝途徑與甘油期相同，前面有所介紹，這不過多重復(fù)，主要反應(yīng)有： （2-4） （2-5） (

33、2-6)同前所述。2.2巴斯德畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶過程中的主要影響因素2.2.1碳源的影響 甘油是菌體生長階段普遍采用的碳源,通過補料加入培養(yǎng)基,其濃度過低或過高會限制或抑制菌體生長,因此,需要優(yōu)化初始甘油濃度,選擇有效的補料方式。葡萄糖也可作為碳源,雖效果不如甘油,但性價比卻優(yōu)于甘油, 以葡萄糖代替甘油將有利于工業(yè)化生產(chǎn)。甲醇是誘導(dǎo)表達階段的碳源,其濃度(CMeOH )和補料方式是關(guān)鍵。CMeOH過低,會限制菌體生長和誘導(dǎo)強度; CMeOH過高,則對菌體產(chǎn)生毒性。甲醇最佳濃度一般在0. 5% 3% ( v/v) ,但有些蛋白高于3%,因此,不同蛋白的最佳濃度不同,需通過實驗并結(jié)合補料策略

34、確定。CMeOH通過補料調(diào)節(jié)并保持恒定,其檢測控制方法有溶氧反饋控制、甲醇離線控制和在線控制,而甲醇在線控制最優(yōu)。2.2.2氮源的影響氨水常作為氮源,并用于調(diào)節(jié)pH,其釋放的NH4濃度對菌體生長、蛋白表達和降解有重要影響。濃度過低,限制菌體生長,并增加蛋白的降解;濃度過高,雖可減少蛋白降解,卻會抑制菌體生長和蛋白表達。因此, NH4+濃度需要優(yōu)化,并采用恒濃度或變濃度法調(diào)控。謝靜莉等在發(fā)酵后期添加(NH4 ) 2 SO4 ,使NH4+濃度維持在150mmol/L以上,蛋白表達量提高58. 8%。采用變濃度法調(diào)控NH4+濃度后,既促進菌體生長,提高表達量,又降低蛋白酶降解。2.2.3基礎(chǔ)鹽和PT

35、M1微量鹽的影響在表達分泌蛋白時,需降低基礎(chǔ)鹽濃度?；A(chǔ)鹽。濃度過高,會導(dǎo)致菌體死亡,并增加蛋白酶釋放,增加蛋白降解。Surribas等以電導(dǎo)率反映基礎(chǔ)鹽濃度,將初始電導(dǎo)率降為30% ,并在誘導(dǎo)過程維持在20%后,菌體死亡率下降。Zhao等將基礎(chǔ)鹽濃度降為1 /4時,誘導(dǎo)前后菌體死亡率分別降低83. 3%和48. 6% 59. 2% ,菌體密度增加25% , HAS2IFN22b表達量提高92. 0% ,并保持恒定。PTM1 微量鹽溶液成分過于復(fù)雜,不能高溫滅菌,易形成沉淀且價格較高,不利于大規(guī)模發(fā)酵,可用低濃度的酵母抽提物來替代PTM1 微量鹽,簡化工藝,也可用麥芽汁來替代,性價比可大幅提高

36、,即簡化工藝又降低成本,有利于工業(yè)化生產(chǎn)。2.2.4添加其它物質(zhì),降低蛋白酶降解在培養(yǎng)基中添加VitC、VitE可以減少菌體死亡,減少蛋白酶的分泌;添加蛋白胨或酪蛋白水解物等底物,競爭性抑制蛋白酶活性;添加蛋白酶抑制劑或EDTA,抑制蛋白酶活性, 它們都能降低蛋白酶降解。Xiao等添加VitC并維持在410mmol /L后,菌體死亡率降低65. 4% ,水蛭素降解程度降低30. 2% ,完整蛋白的表達量提高56. 8%。Zhao等在誘導(dǎo)前添加2%大豆胨后, HAS2IFN22b只有極輕微的降解。Ayed等添加酪蛋白水解物并維持在0. 1%或EDTA 并維持在10mmol /L后,均能阻止h I

37、FN2b 的降解,前者使產(chǎn)物保持恒定,后者使表達量提高65%。2.2.5pH的影響pH對菌體生長和誘導(dǎo)表達都會產(chǎn)生影響,尤其是誘導(dǎo)時的pH,不僅會影響蛋白表達量和活性,而且會通過影響蛋白酶活性,來改變蛋白的降解程度。如當pH由3升至7時, rHSA的降解逐漸減少。因此,必須選擇合適的pH,一般在3. 07. 0,而且在不同階段,應(yīng)選擇不同pH,采用變pH發(fā)酵。pH一般是通過補加氨水來調(diào)節(jié),若NH4+濃度過高,則改為補加堿來調(diào)節(jié)。2.2.6溫度的影響 溫度升高,有利于生長代謝和蛋白表達,但溫度過高反而會使菌體過早衰老,發(fā)酵周期縮短,降低蛋白表達量和活性。因此,必須選擇合適的溫度,而且在不同階段,

38、應(yīng)選擇不同的溫度,采用變溫發(fā)酵。菌體生長最適溫度為30,誘導(dǎo)表達的最適溫度應(yīng)降低,常為20-28,尤其是分泌蛋白,低溫更有利于表達。低溫可以降低折疊壓力,有利于新生肽鏈的正確折疊;降低菌體死亡率,減少蛋白酶分泌,降低蛋白酶活性;提高AOX酶活性和轉(zhuǎn)錄水平,還可以提高蛋白穩(wěn)定性。2.2.7溶氧濃度(DO )的影響高密度發(fā)酵需要消耗大量的氧氣,尤其是在甲醇誘導(dǎo)階段,供氧往往成為限制性因子。若供氧不足,不僅會抑制菌體呼吸作用,限制菌體生長繁殖,而且會積累甲醇及其代謝產(chǎn)物甲醛和過氧化氫,對菌體產(chǎn)生毒害,降低蛋白表達量。因此,必須保證足夠的供氧,一般DO20% 30% , DO也不能太高,超過60% ,

39、細胞就會發(fā)生氧中毒。2.2.8誘導(dǎo)前菌體密度( CWPT I )與比生長速率(PT I )的影響CWPTI和PTI分別反映菌體生物量和生理狀態(tài),提高CWPTI和PTI均能有效提高蛋白表達量。提高CWPTI可以提高誘導(dǎo)階段的生物量,并使更多的甲醇轉(zhuǎn)向蛋白合成，,從而提高表達量;提高PTI可以增強菌體翻譯效率,轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)時,可迅速合成酶系代謝甲醇,快速表達出蛋白, 提高比生產(chǎn)速率和表達量。 第三章 木聚糖酶發(fā)酵的工藝流程3.1高效分泌木聚糖酶的畢赤酵母工程菌株的獲得運用RTPCR 從黑曲霉AN070902 中克隆木聚糖酶cDNA 片段，與載體pPIC9K 相連，構(gòu)建重組載體VMANpPIC9K，電轉(zhuǎn)

40、化畢赤酵母GS115，篩選產(chǎn)酶最高菌株進行液體發(fā)酵。在該項設(shè)計中，高效產(chǎn)酶菌株由工廠準備并儲存。3.1.1材料3.1.2黑曲霉木聚糖酶cDNA 的獲得3.1.3表達載體VMANpPIC9K 的構(gòu)建3.1.4重組菌株VMANpPIC9KGS115 的獲得和高酶活菌株的篩選3.1.5重組畢赤酵母的擴大培養(yǎng) 將可以分泌木聚糖酶的重組畢赤酵母加入到大型種子罐中進行擴大培養(yǎng)，種子罐操作。(1)溫度控制：30±1。(2)(NH4)2S04：添加量：5Kg/m3。(3)罐壓：0.05MPa。(4)通風控制：O6h，3640m3/h；711h，漸增至72m3/h；1215h，漸增至144m3/h；1

41、619h，180m3/h；2024h，280288m3/h：24h后，360m3/h；加大風量，可使菌體生長速率加快，但菌體呼吸強度和雜菌生成量可能增加。(5)培養(yǎng)時間：36h。本設(shè)計一級種子罐培養(yǎng)時間為20h，二級種子罐培養(yǎng)時間為16小時。(6)攪拌速率：220r/min3.2重組巴斯德畢赤酵母工程菌發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶3.2.1原料（1）原料的選擇1、選來源豐富、質(zhì)量好、且便于儲存運輸?shù)脑希?、因地制宜，就近取材，盡量降低成本；3、符合生產(chǎn)工藝要求；（2）菌種:根據(jù)實際需要，本次設(shè)計用到的重組巴斯德畢赤酵母基因工程菌由本實驗室構(gòu)建（如上所述）并保藏。（3）培養(yǎng)基及所需溶液: YPDs/Zeo

42、ein:1og/L酵母膏、Zog/L蛋白陳、209/L葡萄糖、log/L瓊脂、100mg/LZeoein。YPD:10歲L酵母膏、20留L蛋白陳，20留L葡萄糖、10留L瓊脂。BMGY:1og/L酵母膏、Zog/L蛋白陳、20g/L葡萄糖、Zog/L瓊脂、 0.05mol幾磷酸鉀緩沖液，pH=6.0， 13.4g/LYNB，4xl04g/L生物素、20g/L甘油、o.05moFLL一eys?；A(chǔ)鹽溶液(FM21):CaS04·2H20 1.5; KOH 6.5; MgS04·7Hz0 19.5; K2S04 23.8; H3P04 85% 3.5%(v/v)。微量元素溶液(

43、PTM1):ZnC12 2; FeS04·7H20 6.5; H3B03 0.002;MnSO4·H20 0.3;H2S04 96% 0.2% (v/v);CuS04·5H2O 0.6; KI 0.01;biotin 80 ug l-1。種子培養(yǎng)基:甘油10; peptone 20; yeast extract 10; KH2P04 1.2; Na2HP04 2.29;(NH4)S04 1;MgS04·7H20 1;FeS04·7Hz0 0.25。甘油期間歇發(fā)酵培養(yǎng)基:甘油40; biotin 80 ug l-1; H3P04 85% 2% (

44、v/v)和-定量的FM21和PTM 1。甘油期流加發(fā)酵培養(yǎng)基:50% (V/V)的甘油配以一定量的FM21和TM l 。甲醇期流加發(fā)酵培養(yǎng)基:100%的甲醇配以一定量的FM21和PTM l 。蛋白陳、酵母膏購自O(shè)XOID公司;其它試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。3.2.2重組菌株的液體發(fā)酵菌體在種子罐中培養(yǎng)后，然后以10%的接種量進行補料-分批發(fā)酵，發(fā)酵罐的總體積為60m3，工作體積為48m3。發(fā)酵過程采用了Invitrogen Corporation的發(fā)酵規(guī)范（Carlsbad, CA, USA, 2002），整個發(fā)酵過程分為甘油期和甲醇期兩個階段。甘油期以甘油為唯一碳源，目的是細胞高密度培養(yǎng)

45、，發(fā)酵溫度為30；甲醇期以甲醇為唯一碳源，以生成目標蛋白為目的。甘油期又分為甘油間歇期(16-20 h)和甘油流加期(14-18 h)，甲醇期分為甲醇誘導(dǎo)期(5-10 h)和產(chǎn)物生成期(140-160 h)。發(fā)酵全程通過調(diào)節(jié)攪拌速率使溶氧濃度維持在30%左右，溶氧電極為INPRO6100/120/T/N（Mettler-Toledo, Switzerland）；通過流加氨水控制pH5.5，pH電極為405-DPAS-SC-K8S/120（Mettler-Toledo, Switzerland）。甘油、甲醇和氨水的流加均使用校正好的蠕動泵（Watson 101）進行流加。3.2.3發(fā)酵工序1、無

46、菌空氣的制備：利用溶解于溶液中的氧，其來源則是通過壓縮機提供的壓縮空氣。自然界的空氣是帶塵和細菌的空氣，且通過壓縮機壓縮和管道輸送，增加了水、油污、金屬屑等雜物，因此進入發(fā)酵罐的空氣，必須是通過適當?shù)姆椒ㄌ幚砗蟮母蓛?、無菌空氣。2、滅菌工序技術(shù)工藝條件：(1)種子罐:空罐 120，30min；(2)發(fā)酵罐：空罐 120，30min；(3)接種管道、料管：2.53.0kgf/cm2,120,20min。(4)總空氣管道：120150，2.53.0kgf/cm2,1h,每月一次。(5)無菌室：每周甲醛消毒一次，每天藥物消毒一次，每次使用前用紫外燈消毒20min。(6)注意隨時用漂白粉或其他藥物維持

47、環(huán)境不污染。3、發(fā)酵罐操作：(1)溫度：30±1。(2)接種量：1:10(每10m3發(fā)酵罐對應(yīng)1m3種子罐)。(3)罐壓：O.05MPa(表壓)。(4)風量控制：018h，0.08v.v.m；1830h，0.1v.v.m；30h，0.12v.v.m。(5)攪拌轉(zhuǎn)速：220r/min(6)pH控制：3-7，一般最佳為5.5。(7)容氧：30%以上(8)發(fā)酵周期：50h， 比現(xiàn)有周期短80小時。(9)發(fā)酵過程控制：每 12 h 補加一次甲醇，碳源：1.0的甲醇混合 0.1的甘油，氮源：常以氨水做氮源，發(fā)酵后期添加5(NH4 ) 2 SO4 ,使NH4+濃度維持在150mmol/L以上(2

48、 g/ L 左右)， 補料：流加50%的甘油、PTM鹽、液氨等，過程中細胞濃度達到220-250 g/L。底物流加方法：在誘導(dǎo)初始階段, 細胞處于由甘油代謝向甲醇代謝的過渡適應(yīng)期, 甲醇比消耗速率不斷增加。當細胞完全適應(yīng)甲醇環(huán)境后, 處于非生長狀態(tài)下的畢赤酵母甲醇比消耗速率維持恒定。在這個階段, 底物的流加策略主要有直接添加甲醇及流加甘油和甲醇混合物兩種方式。大量的研究表明, 流加甘油和甲醇混合物更有利于外源蛋白的高效表達。事實上, 高密度補料 批式發(fā)酵過程中, 在誘導(dǎo)初期, 流加甘油和甲醇的混合底物而不單獨流加甲醇的話, 菌體就不會由于甲醇的積累而中毒。此外, K atakura等研究表明,

49、 在畢赤酵母高密度補料- 批式發(fā)酵過程中, 在過渡階段流加甘油/甲醇混合底物有助于菌體更快地進行甲醇代謝 。因此, 使用甘油和甲醇的混合底物比只使用甲醇作為唯一碳源的底物能更快地誘導(dǎo)醇氧化酶和更快地適應(yīng)細胞的代謝活動。因為甘油通過提供能量和甲醇代謝酶類所需的構(gòu)件有助于甲醇代謝酶類的表達, 從而避免甲醇對菌體的毒害作用。5.甲醇流加的方法甲醇傳感器在線檢測控制甲醇的流加： 通過在線檢測甲醇濃度控制甲醇的流加, 由于傳感器靈敏度高, 響應(yīng)時間短, 因此能有效地控制甲醇的流加速率, 使甲醇的濃度維持恒定, 同時有效地解決甲醇抑制時實現(xiàn)恒化培養(yǎng)問題, 是目前為止最好的一種檢測甲醇濃度的方法。3.3發(fā)酵

50、液后處理獲得木聚糖酶3.3.1離心 離心沉降設(shè)備有瓶式離心機、管式離心機、多室式離心機和碟片式離心機。用于分離生物化學產(chǎn)品的離心機通常為碟片式離心機。本設(shè)計采用噴嘴排渣的碟片式離心機，具有堅硬的外殼，底部突出，與外殼鑄在一起，殼上由圓錐形蓋，由螺母緊固在外殼上，殼由高速旋轉(zhuǎn)的倒錐形轉(zhuǎn)鼓帶動，其內(nèi)設(shè)有數(shù)十片錐角為60120°的錐形碟片,可進行連續(xù)離心。 碟片用0.8mm的不銹鋼制成，碟片之間的間隙為0.52.5mm。在轉(zhuǎn)鼓直徑最大處，裝有孔徑為0.53.2mm的噴嘴，一般為224個，由于排渣的含液量較高，具有流動性，故噴嘴排渣的碟片式離心機可進行發(fā)酵液的濃縮。轉(zhuǎn)鼓直徑可達900mm，最

51、大處理量為300m³/h。 根據(jù)現(xiàn)有型號，選用JMDJ211VC-03C離心機，處理量為1015t/h，分離因數(shù)9000，動力22KW。3.3.2干燥 按照熱能傳遞給濕物料的方式，干燥方法可分為直接干燥，間接干燥和介電加熱干燥。對于一般的發(fā)酵車間采用的是直接干燥的方式，本設(shè)計采用的是噴霧干燥器發(fā)酵液干燥為固體顆粒。通過利用噴霧器將發(fā)酵液噴成霧狀，形成具有較大表面積的分散微粒同熱空氣發(fā)生強烈的熱交換，迅速排除本身的水分，在短時間內(nèi)獲得干燥。 1.霧化器的選擇 將料液分散為霧滴的霧化器是噴霧干燥器的關(guān)鍵部件，常用的三種霧化器是氣流式霧化器、壓力式霧化器和旋轉(zhuǎn)式霧化器。本設(shè)計中發(fā)酵液屬于一般溶液，壓力為低壓，產(chǎn)品為微細固體，應(yīng)采用旋轉(zhuǎn)式霧化器。 2.開放式噴霧干燥系統(tǒng) 干燥介質(zhì)在整個系統(tǒng)中只使用一次就排入大氣中，不在循環(huán)使用。 3.霧滴和熱風的接觸方式為并流式 由于所生產(chǎn)的酶為熱敏性物質(zhì)，應(yīng)經(jīng)量降低發(fā)酵液的溫度，采用并流式使得最熱的熱風與濕含量最大的霧滴接觸，因而濕份迅速蒸發(fā)，霧滴表面溫度接近空