HBV-DNA熒光定量PCR檢測(cè)的室內(nèi)質(zhì)控研究

1、HBV-DNA熒光定量PCR檢測(cè)的室內(nèi)質(zhì)控研究作者：呂虹 周亞莉 張國(guó)軍 方芳 王雅杰 閆惠平 康熙雄作者單位：首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心，北京 100050； 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染與免疫中心，北京 100069 【摘要】 目的 研究HBV-DNA熒光定量PCR檢測(cè)室內(nèi)質(zhì)控管理體系。 方法 自 作者：呂虹 周亞莉 張國(guó)軍 方芳 王雅杰 閆惠平 康熙雄作者單位：首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心，北京 100050； 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染與免疫中心，北京 100069 【摘要】 目的 研究HBV-DNA熒光定量PCR檢測(cè)室內(nèi)質(zhì)控管理體系。 方法 自制H

2、BV-DNA陽(yáng)性質(zhì)控血清，連續(xù)測(cè)量20次，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，從第3次開(kāi)始利用即刻法進(jìn)行質(zhì)控，20次以后利用質(zhì)控圖法進(jìn)行質(zhì)控。 結(jié)果 自制陽(yáng)性質(zhì)控血清均一性和準(zhǔn)確度均達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，用即刻法檢測(cè)320次質(zhì)控結(jié)果均小于N2S數(shù)值，在控制范圍內(nèi)，用質(zhì)控圖法檢測(cè)HBV-DNA室內(nèi)質(zhì)控對(duì)數(shù)值的均值為5.54，標(biāo)準(zhǔn)差為0.22，CV為3.9%，穩(wěn)定性好，有臨床應(yīng)用價(jià)值，質(zhì)控圖利用EXCEL表格標(biāo)示出警告限和失控限，有利于動(dòng)態(tài)監(jiān)控質(zhì)控結(jié)果。 結(jié)論 聯(lián)合即刻法和質(zhì)控圖法對(duì)于應(yīng)用熒光定量PCR的方法進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)的室內(nèi)控制切實(shí)可行。 【關(guān)鍵詞】 乙肝-DNA 熒光定量 室內(nèi)質(zhì)控 即刻法 質(zhì)控圖

3、隨著臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法和臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范的貫徹實(shí)施，全國(guó)各地陸續(xù)規(guī)范地開(kāi)展熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，與常規(guī)PCR技術(shù)相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有特異性強(qiáng)，能有效解決PCR產(chǎn)物污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)1,2。但由于熒光定量檢測(cè)試劑盒效期較短，連續(xù)檢測(cè)20次后做質(zhì)控圖時(shí)間較長(zhǎng)，如果采用即刻法和質(zhì)控圖法相結(jié)合對(duì)HBV-DNA室內(nèi)質(zhì)控進(jìn)行控制，并利用EXCEL表格繪制動(dòng)態(tài)質(zhì)控圖，能對(duì)室內(nèi)質(zhì)控管理體系起到良好的監(jiān)控作用。 1 材料和方法 11 材料 質(zhì)控血清來(lái)自北京天壇醫(yī)院肝病門診肝炎患者血清，經(jīng)乙肝五項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果為HBsAg+、HBeAg+、抗HBcAb+的血清樣本10例

4、，充分混勻；經(jīng)乙肝五項(xiàng)、丙肝、HIV檢測(cè)全陰性的血清樣本10例，充分混勻。以上兩組血清樣本均無(wú)黃疸、無(wú)脂血、無(wú)溶血現(xiàn)象，將其進(jìn)行56 30min滅活，并將以上兩混合樣本以適當(dāng)比例混合，使其檢測(cè)預(yù)期濃度在105106IU/ml之間。將質(zhì)控品充分混勻，保證其均一性。取高壓滅菌的0.5ml離心管數(shù)只，將上述質(zhì)控品每管110l分裝至離心管中，瞬時(shí)離心數(shù)秒，蓋蓋，用封口膜將其封口后直立放入-70冰箱冷凍保存。使用時(shí)取出后室溫融解，震蕩混勻，瞬時(shí)離心數(shù)秒后使用;試劑使用上海復(fù)星公司HBV-DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒;羅氏lightcycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，高速低溫離心機(jī)，恒溫金屬浴，微量移液器

5、等。 1.2 方法 取10只陽(yáng)性質(zhì)控血清，在同一實(shí)驗(yàn)室，同一操作人員使用同一臺(tái)儀器、同批號(hào)試劑進(jìn)行操作，對(duì)制備的質(zhì)控品的均一性進(jìn)行檢測(cè)。每次臨床檢測(cè)均設(shè)空白對(duì)照1份、陰性對(duì)照1份、陽(yáng)性質(zhì)控品1份、標(biāo)準(zhǔn)品4份（濃度分別為7.5107IU/ml、7.5106IU/ml、7.5105IU/ml、7.5104IU/ml），連續(xù)檢測(cè)3次后即可對(duì)第3次檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控；連續(xù)檢測(cè)20次后即可繪制質(zhì)控圖，對(duì)20次以后的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。 1.21 “即刻法”質(zhì)控方法 將連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值按從小到大的順序排列，即X1、X2、X3、X4Xn（X1為最小值，Xn為最大值）。計(jì)算均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）;按公式SI上

6、限值=X最大值-XSD計(jì)算SI上限值和SI下限值：SI下限值=X-X最小值SD將SI上限值和SI下限值與SI值表（表1）中的數(shù)值比較。 122 質(zhì)控結(jié)果的判斷 SI上限值和SI下限值均小于表1中N2S對(duì)應(yīng)的值時(shí)，說(shuō)明測(cè)定質(zhì)控值的變化在兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差之內(nèi)，是可以接受的。如SI上限值和SI下限值中之一處于N2S和N3S對(duì)應(yīng)的值之間時(shí)，說(shuō)明該質(zhì)控測(cè)定值的變化在兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差和三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差之間，處于“警告”狀態(tài)。當(dāng)SI上限值和SI下限值之一大于N3S對(duì)應(yīng)的值時(shí)，說(shuō)明該質(zhì)控測(cè)定值的變化已超過(guò)三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，屬“失控”狀態(tài)。 表1 “即刻法”質(zhì)控SI值表（略） 1.23 質(zhì)控圖法質(zhì)控方法 將20次質(zhì)控結(jié)果輸入EXCEL

7、表格，并利用電腦計(jì)算出均值X2S及X3S，并以X2S為警告線，X3S為失控線，繪制質(zhì)控圖。將20次質(zhì)控樣本的結(jié)果取對(duì)數(shù)值，輸入B4到B23，將X-2S、X+2S、X、X-3S、X+3S的數(shù)值輸入C4-G4和C23-G23，用鼠標(biāo)從B4拖到G23，按工具欄中的“圖表向?qū)А秉c(diǎn)擊“折線圖”，按“完成”可得到質(zhì)控圖的基本輪廓，去除掉數(shù)值軸網(wǎng)絡(luò)線。以X3S為失控線，以X2S為警告線。將鼠標(biāo)移至X+3S上兩個(gè)失控點(diǎn)中的任意一個(gè)點(diǎn)，右擊后選擇“添加趨勢(shì)線”，選擇“線性L”，按“確定”鍵，兩端點(diǎn)連成直線，即成失控線。用相同的方法繪制出警告線和均值線。 2 結(jié)果 2.1 準(zhǔn)確性評(píng)價(jià) 每批次實(shí)驗(yàn)同時(shí)做空白對(duì)照一份

8、，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各一份，HBV-DNA陽(yáng)性質(zhì)控品1份，標(biāo)準(zhǔn)品4份，分別為7.5107IU/ml、7.5106IU/ml、7.5105IU/ml、7.5104IU/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，空白對(duì)照和陰性對(duì)照為陰性結(jié)果，陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性結(jié)果，陽(yáng)性質(zhì)控品為陽(yáng)性結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)品呈線性關(guān)系，r值=-1.00，Error=0.0232。表明每次實(shí)驗(yàn)均在控制之中，而且每次實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性均有保證，試驗(yàn)結(jié)果可信。參見(jiàn)圖12。 圖1 HBV-DNA標(biāo)準(zhǔn)品7.5107104IU/ml擴(kuò)增曲線（略） 圖2 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，Slope=-3.524，Intercept=47.7，Error=0.0232，r=-1.00（略）

9、2.2 質(zhì)控品均一性評(píng)價(jià) 一次性檢測(cè)10份陽(yáng)性質(zhì)控血清，病毒載量對(duì)數(shù)值的均值為5.54，標(biāo)準(zhǔn)差為0.08，CV為1.5%。質(zhì)控品均一性較好（圖3）。 圖3 10份HBV-DNA質(zhì)控品均一性檢測(cè)擴(kuò)增曲圖（略） 2.3 將第120次質(zhì)控結(jié)果記錄于即刻法質(zhì)控表中（表2），計(jì)算SI上限值和SI下限值，通過(guò)查表1可得該20次質(zhì)控結(jié)果均小于N2S數(shù)值，在控制范圍內(nèi)。 2.4 經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的普通操作人員在儀器、試劑、設(shè)備及環(huán)境常規(guī)的狀態(tài)下進(jìn)行連續(xù)20次檢測(cè)，得出常規(guī)條件下的變異（RCV）結(jié)果，病毒載量對(duì)數(shù)值的均值為5.54，標(biāo)準(zhǔn)差為0.22，CV為3.9%。 2.5 應(yīng)用EXCEL表格繪制出Levey-Jenn

10、ings質(zhì)控圖，依據(jù)20次質(zhì)控結(jié)果計(jì)算出X和SD確定質(zhì)控限，依據(jù)其原則定X2SD為警告限，X3SD為失控限（圖4），并用黃色表示警告限，紅色表示失控限。將每批次實(shí)驗(yàn)所做質(zhì)控結(jié)果取對(duì)數(shù)值后直接輸入相應(yīng)EXCEL單元格中，圖表將自動(dòng)顯示本次實(shí)驗(yàn)質(zhì)控結(jié)果在質(zhì)控圖中的位置，檢測(cè)每次實(shí)驗(yàn)質(zhì)控結(jié)果情況及質(zhì)控趨勢(shì)。 3 討論 在全面質(zhì)量管理體系中，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)3。“即刻法”質(zhì)控實(shí)際上是數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理方法中應(yīng)用Grubbs剔除異常值的方法在免疫質(zhì)控中的應(yīng)用4，該法只需要連續(xù)測(cè)定3次，即可對(duì)3次結(jié)果中異常值進(jìn)行檢驗(yàn)，比較簡(jiǎn)單，因此在臨床檢驗(yàn)方面應(yīng)用較廣，尤其是在免疫檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控，如HBsAg檢

11、測(cè)，抗-HIV檢測(cè)，抗-HCV檢測(cè)，抗梅毒抗體檢測(cè)5,6等，同時(shí)在血細(xì)胞檢測(cè)方面也有相關(guān)報(bào)道7。我們把“即刻法”室內(nèi)質(zhì)控應(yīng)用于臨床基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中，優(yōu)點(diǎn)更為突出。 表2 20次熒光定量PCR方法檢測(cè)HBV-DNA室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)結(jié)果（略） 圖4 HBV-DNA室內(nèi)質(zhì)控圖（略） 雖然近年來(lái)，隨著臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法和臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范的貫徹實(shí)施，以及衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心對(duì)全國(guó)各地部分臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收工作的陸續(xù)展開(kāi)，許多地區(qū)臨床基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室已開(kāi)展臨床基因檢測(cè)工作，但是一些實(shí)驗(yàn)室在質(zhì)量控制尤其是室內(nèi)質(zhì)控方面仍存在很大問(wèn)題8，“即刻法”質(zhì)控能很好的克服傳統(tǒng)單一應(yīng)用質(zhì)

12、控圖法必須連續(xù)檢測(cè)質(zhì)控血清20次后才能進(jìn)入質(zhì)控的缺陷，在測(cè)定3次后即可進(jìn)入質(zhì)控狀態(tài)，監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠程度，為樣本量較少、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)室提供了良好的質(zhì)量保證。雖然“即刻法”可以解決室內(nèi)質(zhì)控的一些問(wèn)題，但它仍然存在一些問(wèn)題9， “即刻法”前3次結(jié)果對(duì)后續(xù)質(zhì)控結(jié)果影響較大；當(dāng)前3次結(jié)果精確度很好時(shí)，對(duì)后續(xù)質(zhì)控結(jié)果的精確度要求亦較高，否則容易出現(xiàn)失控，且多為假失控；當(dāng)前3次結(jié)果不穩(wěn)定，s較大時(shí)，對(duì)后續(xù)質(zhì)控結(jié)果影響更大，后續(xù)結(jié)果中會(huì)出現(xiàn)較多的假在控和假失控?！凹纯谭ā蓖瑯硬荒芘袛噙B續(xù)趨勢(shì)性上升或下降失控，對(duì)試劑的靈敏度也不能進(jìn)行監(jiān)控。 質(zhì)控圖能直觀的監(jiān)測(cè)質(zhì)控結(jié)果及其變化趨勢(shì)，但質(zhì)控圖本身只是一種工

13、具，因此也有個(gè)質(zhì)量問(wèn)題，即它具備什么條件才能真正起到過(guò)程控制作用10。當(dāng)一個(gè)質(zhì)控圖繪制成功，就必須進(jìn)行分析繪制質(zhì)控圖的過(guò)程是否在“控制”條件下進(jìn)行，此時(shí)的質(zhì)控圖實(shí)質(zhì)上是“分析用質(zhì)控圖”。本室質(zhì)控圖繪制后，CV為3.9%，小于臨床允許誤差；20次質(zhì)控值均在X2SD范圍內(nèi)，并符合Westgard質(zhì)控規(guī)則的13S、22S和41S，此質(zhì)控圖可以用做 “管理用質(zhì)控圖”，控制檢驗(yàn)過(guò)程。同時(shí)此質(zhì)控圖繪制出了警告線和失控線，給判斷檢測(cè)結(jié)果數(shù)值是否在控制限內(nèi)提供了方便，大大提高了工作效率，非常有利于臨床推廣應(yīng)用。 所以“即刻法”雖然能解決質(zhì)控中的一些問(wèn)題，但還應(yīng)結(jié)合L-J質(zhì)控圖法相結(jié)合對(duì)HBV-DNA的熒光定量

14、檢測(cè)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，這樣綜合兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于應(yīng)用熒光定量PCR的方法進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)的室內(nèi)控制不失為一種切實(shí)可行的方法。 【參考文獻(xiàn)】 1 Jardi R, Rodriguez F, Buti M, et al. Quantitative detection of hepatitis B virus DNA in serum by a new rapid real-time fluorescence PCR assayJ. J Viral Hepat, 2001, 8:465471.2 Ho SK, Yam WC, Leung EK, et al. Raped quantifica

15、tion of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using fluorescent hybridization probesJ. J Med Microbiol, 2003,52:397402.3 王治國(guó),李小鵬,武平原. 臨床檢驗(yàn)定量測(cè)定室內(nèi)質(zhì)控系統(tǒng)的建立J.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2004，19：69.4 秦曉光.適用于免疫測(cè)定的“即刻法”質(zhì)控方法-Grubbs氏異常值取舍法J.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1992，15：37.5 張惠榮,耿海杰. ELISA檢測(cè)HIV抗體“即刻法”室內(nèi)質(zhì)控J. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005,15(4)：491.6 徐慶華，殷仰周，董麗丹. 抗-HCV試劑的“即刻法”室內(nèi)質(zhì)控J.中國(guó)輸血雜志，2001，14（