重組梅毒螺旋體抗原的研究進(jìn)展

1、重組梅毒螺旋體抗原的研究進(jìn)展    摘要nbsp;在梅毒螺旋體人工培養(yǎng)尚未獲得成功的情況下，基因克隆（即DNA重組）技術(shù)的出現(xiàn)為該病原的研究開(kāi)辟了一條新的途徑。應(yīng)用基因工程技術(shù)目前已制備出多種重組梅毒螺旋體抗原，這些抗原的制備對(duì)梅毒發(fā)病機(jī)理的探討、疫苗的研制、以及血清學(xué)診斷試驗(yàn)的建     尹躍平  國(guó)外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊(cè)1999年第25卷第6期 摘要 在梅毒螺旋體人工培養(yǎng)尚未獲得成功的情況下，基因克隆（即DNA重組）技術(shù)的出現(xiàn)為該病原的研究開(kāi)辟了一條新的途徑。應(yīng)用基因工程技術(shù)目前已制備出多種重組梅毒螺旋

2、體抗原，這些抗原的制備對(duì)梅毒發(fā)病機(jī)理的探討、疫苗的研制、以及血清學(xué)診斷試驗(yàn)的建立與應(yīng)用具有重要意義，為梅毒的預(yù)防和控制提供了更加有效的手段。 一、概況 梅毒是一種臨床表現(xiàn)極為復(fù)雜，幾乎可累及全身各器官的性病。盡管本世紀(jì)40代年發(fā)現(xiàn)了治療梅毒的理想藥物青霉素，但目前該病在全球仍然是一項(xiàng)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題1。目前尚未解決梅毒的病原體梅毒螺旋體（Treponema pallidum,TP）的人工培養(yǎng)問(wèn)題，從而阻礙了對(duì)TP致病機(jī)理探討、疫苗研制、以及梅毒血清學(xué)診斷技術(shù)開(kāi)發(fā)等方面的深入研究。80年代初，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是基因工程（DNA重組）技術(shù)的出現(xiàn)使梅毒螺旋體的研究進(jìn)入一個(gè)新的階段2，

3、目前，TP的全部基因組DNA序列已經(jīng)被解析1。通過(guò)重組TP dNA的克隆以及在大腸桿菌中的表達(dá)，制備出多種重組TP抗原，為梅毒的研究提供了一條新的途徑。現(xiàn)就近10年來(lái)有關(guān)重組TP抗原的研究現(xiàn)況進(jìn)行復(fù)習(xí)。 二、重組TP抗原的特性及制備 目前已重組的TP抗原有近20多種，如TpN15、TpN17、TpN19、TpN2935（TpD）、TpN44.5（TmP a）、TpN47、TpN35(Tmp c)等3?，F(xiàn)將其中部分有應(yīng)用前景的重組TP抗原分述如下。 （一）TP15kD抗原4：15kD蛋白是一種脂蛋白，首先由Hensel等1985年分離鑒定，它在TP膜蛋白中的含量相對(duì)較少，但在免疫印跡試驗(yàn)中與人梅

4、毒血清間顯示了超強(qiáng)的反應(yīng)性，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)梅毒兔的淋巴細(xì)胞有很強(qiáng)的增生反應(yīng)，表明15kD蛋白不僅具有較強(qiáng)的體液免疫原性，而且有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫原性，但Centurion-Lara等5實(shí)驗(yàn)表明，此蛋白對(duì)TP感染沒(méi)有任何免疫保護(hù)性。重組15kD抗原基因由Norgard等用特異的單克隆抗體從TP基因庫(kù)中篩選得到4。其最新報(bào)道的表達(dá)質(zhì)粒為pMALc25，該質(zhì)粒在DNA插入位點(diǎn)的上游含有麥芽糖結(jié)合蛋白基因，使表達(dá)的融合蛋白易于分離和提純。 （二）4D抗原：4D抗原是分子量分19kD的一種TP外膜蛋白，Radolf等6研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是自然狀態(tài)還是重組4D蛋白都由二巰鍵交叉相聯(lián)成寡聚結(jié)構(gòu)，且耐蛋白酶，表明4D抗原可

5、能在TP外膜保持完整結(jié)構(gòu)中起著非常重要的作用。重組TP4D抗原首先由Feniger等在E coli RRI大腸桿菌中表達(dá)和分離提純7。Borenstein等用肌注和靜脈注射的方法探討了重組TP 4D抗原對(duì)實(shí)驗(yàn)性梅青的影響，顯示以4D抗原免疫動(dòng)物后能夠改變實(shí)驗(yàn)梅毒的病程，表明4D抗原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，可對(duì)感染梅毒產(chǎn)生部分保護(hù)的作用。提示重組TP抗原是制備疫苗的又一可能途徑。 （三）TP24 kD抗原：此重組蛋白是以質(zhì)粒pUC8為載體在大腸桿菌中表達(dá)的一種分泌蛋白8，具有很強(qiáng)的免疫原性，其編碼TP24kD抗原的DNA序列僅存在于致病性的TP基因中，而非致病性TP中不存在此DNA序列，提示TP24kD

6、抗原與TP的致病性相關(guān)，但與TP致病性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。Hsu等人的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重現(xiàn)24kD的表達(dá)可以改變大腸桿菌的生長(zhǎng)形態(tài)，出現(xiàn)與一般大腸桿菌不一樣的扁平粗糙的菌落和絲狀樣生長(zhǎng)，表明24KD抗原與TP的生長(zhǎng)特性相關(guān)。 （四）TmP A和TmP B：TmP a是一個(gè)分子量為42kD的TP膜蛋白。Schouls9等構(gòu)建了能在大腸桿菌K-12中大量表達(dá)該重組蛋白的質(zhì)粒載體pPLc245。Ijsselmuiden等10用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法探討了重組TmPA抗原在血清學(xué)診斷中的意義，通過(guò)對(duì)148例未治療和167例已治療的梅毒血清以及190例非梅毒血清進(jìn)行了檢測(cè)，其敏感性分別為：一期

7、梅毒76%、二期梅毒100%、早期穩(wěn)性梅毒98%，在治療后1年以內(nèi)的梅毒患者中，其抗TmP a的滴度明顯下降，這表明TmP a不僅在梅毒血清診斷中有意義，而且可望用于梅毒治療效果的監(jiān)測(cè)。TmP b基因位于TmP A基因下游9。Schouls等人的實(shí)驗(yàn)表明，抗TmP b抗體渡度隨著梅毒患者的治療呈下降趨勢(shì)，因而可望用于梅毒治療的監(jiān)測(cè)。但單獨(dú)用Tmp b抗原不適宜作血清學(xué)診斷，因?yàn)槊范净颊哐宓暮艽笠徊糠謱?duì)Tmp B不起反應(yīng)。Wicher等11用重組TP抗原對(duì)豚鼠進(jìn)行免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組TP抗原中只有TmP B可以改變梅毒的病程，提示重組TmP b抗原在疫苗制備中可能有一定的意義。 （五）TP47

8、kD抗原：該蛋白為T(mén)P整合性膜蛋白抗原，1986年Norgard等12在大腸桿菌中首先克隆及表達(dá)了重組47kD抗原。多中心研究發(fā)現(xiàn)13，此蛋白有很強(qiáng)的免疫原性，在TP中含量非常豐富，且為致病菌特有的蛋白。Chamberlain等12采用含有依賴T7 RNA多聚酶的表達(dá)載體，建立了高效表達(dá)重組47kD的系統(tǒng)，并對(duì)此重組抗原與自TP中分離得到的自然47kD蛋白進(jìn)行了生物學(xué)分析與比較，結(jié)果表明這兩種來(lái)源的47kD抗原其生物學(xué)特性相同，均為含蛋白脂質(zhì)，其疏水性可能與致病性有關(guān)。為了探討疏水性結(jié)構(gòu)與抗原性的關(guān)系，Weigel等14表達(dá)了非?；挠H水性重組47kD抗原，通過(guò)免疫印跡試驗(yàn)對(duì)116例不同期的梅

9、毒血清進(jìn)行檢測(cè)，表明親水性重組47kD抗原的抗原性保持不變，說(shuō)明?；Y(jié)構(gòu)與抗原性無(wú)關(guān)。 除了上述蛋白抗原外尚有多種具有較強(qiáng)抗原性的TP重組抗原，如Tromp2(28kD)15，TmPC(35kD)及34kD抗原等。這些重組抗原的生物學(xué)及免疫學(xué)特性等有待進(jìn)一步探討。 三、重組TP抗原在血清學(xué)診斷中的應(yīng)用 盡管Fujimura等16用ELISA檢測(cè)了不同重組抗原的免疫反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)G17的反應(yīng)性比M47、S42和G15都高。但近年來(lái)的應(yīng)用研究趨向于將2種或2種以上的重組抗原聯(lián)合使用，綜合兩種或多種抗原的不同特性，從而使其具有更高的特異性和敏感性。 （一）15kD與47 kD組合17：目前認(rèn)為15 k

10、D和47 kD是兩種抗原性最強(qiáng)的TP蛋白，Zrein等對(duì)以重組15 kD和47 kD為抗原的酶免疫試劑盒ELISyph-rG的敏感性和特異性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在TPHA檢測(cè)陽(yáng)性的血清中，其ELISyph-rG結(jié)果和TPHA抗體滴度之間的相關(guān)性為0.94。在對(duì)VDRL方法檢測(cè)為陰性的1822份正常健康自愿者血清（其中440份血清用TPHA檢測(cè)為陰性）檢測(cè)后，結(jié)果在這1822份血清中用ELISyph-rG法檢測(cè)出4份陽(yáng)性血清。用FTA-ABS和WB法對(duì)陽(yáng)性血清進(jìn)行進(jìn)一步確證發(fā)現(xiàn)，其敏感性達(dá)100%，特異性大于99.8%，認(rèn)為以重組15 kD和47 kD為抗原的ELISyph-rG法可代替VDRL和TPH

11、A法，適合用于大樣本的篩檢。 （二）15 kD、17 kD、47 kD組：此3種TP抗原存于梅毒的整個(gè)病程中18，包括晚期穩(wěn)性梅毒。尤其對(duì)于伴有HIV感染的梅毒患者在抗TP的含量低于一般梅毒患者的情況下亦能檢測(cè)到抗47 kD抗體。Gerber等3人對(duì)3種重組抗原的聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明18例梅毒患者中，17例患者在整個(gè)病程中均可檢測(cè)到抗體，而42例正常人血清中無(wú)1例抗體陽(yáng)性，提示這種檢測(cè)方法有很高的敏感性和特異性。Young等18對(duì)這3種重組蛋白為抗原的酶免疫試劑盒ICE syphilis(immune-capture EIA)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并與自然TP為抗原的試劑盒Captia Sele

12、ctSyph-G、TPHA、FTA-ABS及VDRL進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示ICE Syphilis的特異性明顯高于Captia selectSyph-G(分別為99.8%與99.2%，P0.02，其敏感性也明顯高于Captia selectSyph-G、FTA-ABS及TPHA（分別為99%100%，P0.01，91.4%92.4%，92.4%和97.1%。在15例伴HIV感染的梅毒患者中，血清ICE syphilis檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而Captia selectSyph-G檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)3例陰性。由此可見(jiàn)，ICE syphilis 檢測(cè)方法的高特異性及高敏感性將為梅毒的篩檢測(cè)提供一種理想的手段。

13、 young等還建立了應(yīng)用這3種重組蛋白為抗原的快速檢測(cè)梅毒的膠乳凝集方法Syphilis fast 19，并通過(guò)檢測(cè)1518份隨機(jī)血清標(biāo)本，對(duì)Captia selectSyph-G和VDRL的特異性進(jìn)行了比較，以及在99份各期梅毒血清和15例篩檢陽(yáng)性的血清中對(duì)其敏感性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其特異性（99.8%）明顯高于Captia SelectSyyph-G（99.2%）和VDRL（99.1%）（P0.02，但其敏感性與Captia selectSyph-G間沒(méi)顯著性差異（分別為93%和92.1%），但這兩種方法的敏感性均顯著高于VDRL（46.5%）(P0.001)。由此可見(jiàn)，Syphilis fa

14、st法可望成為一種特異性高、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便的梅毒篩檢方法。 四、展望 farley 等20認(rèn)為，對(duì)有關(guān)人群進(jìn)行梅毒篩檢是控制和預(yù)防梅毒的重要措施之一。目前常規(guī)用于梅毒篩檢和診斷的血清學(xué)試驗(yàn)主要有兩種，一種是對(duì)脂類(lèi)抗原的非螺旋體試驗(yàn)方法（如VDRL、RPR），另一種是特異性梅毒螺旋體試驗(yàn)（如TPHA、FTA-ABS）。前者敏感性和特異性不高，存在著假陽(yáng)性和假陰性，而后者最大的問(wèn)題是抗原來(lái)源的缺乏，尚未得到解決。因?yàn)門(mén)P目前還不能人工培養(yǎng)，其用于診斷試驗(yàn)的TP主要通過(guò)兔睪丸接種獲得，這既需要一定的實(shí)驗(yàn)室條件，又費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)材料。因此探討重組TP抗原的梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用是制備重組抗原的主

15、要目的之一，重組蛋白的制備使我們能夠在實(shí)驗(yàn)室里得到不同目的抗原，這一方面為建立現(xiàn)有梅毒血清學(xué)診斷的替代方法提供了條件，同時(shí)又為建立特異性和敏感性更高的診斷新方法奠定了基礎(chǔ)，如通過(guò)重組抗原制備單克隆抗體，以建立檢測(cè)梅毒抗原的方法，將為神經(jīng)梅毒、早期隱性梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷提供新的手段。同時(shí)通過(guò)對(duì)不同重組抗原的結(jié)構(gòu)，以及生物學(xué)和免疫學(xué)的分析，可以達(dá)到篩選TP致病因子和開(kāi)發(fā)TP疫苗的目的，為T(mén)P的預(yù)防和治療提供更加有效的手段。 參考文獻(xiàn) 1Fraser gM et al. Science ,1998;281(17):375-388 2.Walfifld aM et al. Science ,1982;2

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