益生注射液抗大鼠腹主動脈移植硬化的實驗研究

1、益生注射液抗大鼠腹主動脈移植硬化的實驗研究摘要目的：探討不同濃度益生注射液A、B兩種組分及聯(lián)合用藥對移植物慢性失功（CAD）的防治效果及作用環(huán)節(jié)。方法：利用組織形態(tài)觀察;計算機象分析;過氧化脂質(zhì)測定和免疫組織化學分析大鼠腹主動脈移植硬化加快模型。結(jié)果：術后6周A+B及驍悉（MMF）治療組能顯著抑制血管內(nèi)膜的增厚，B（10 mg.kg-1）、B(1 mg.kg-1)、A+B組術后各期過氧化脂質(zhì)（LPO）與術前比無明顯差異，各組TGF-1表達高峰在術后2周，空白對照組各時間點的表達最強，A+B及MMF組表達最弱。結(jié)論：A組分通過抑制T、B淋巴細胞及巨噬細胞增殖、浸潤，間接下調(diào)TGF-1的表達，B組

2、分對氧自由基引起的損傷有明顯保護作用，A+B有協(xié)同作用，其作用與MMF單用相當。關鍵詞益生注射液；大鼠；腹主動脈移植中分類號：R969文獻標識號：A文章編號：1006-0103（2000）03-0185-04EXPERIMENTAL STUDY ON YISHENG HERBAL INJECTION ANTIABDOMINAL AORTA SCLEROSIS OF TRANSPLANTATIONBU Hong CHEN Wei-guoLIU Yu-binWU Da-rongCHENG Jing-qiuWANG Li（The First University Hospital, West Chi

3、na University of Medical Sciences, Chengdu 610041 China）Abstract OEJECTIVE:To investigate the precluding effect and processing step of the Yisheng herbal injection in different concentration and coalition usage against CAD. METHODS: By abdominal aorta transplantational sclerosis model in rats.RESULT

4、S: Thickenning of endovascular could be inhibited significantly in 6 weeks after operation and MMF treatment group.There is no significant difference in LPO of B(10 mg.kg-1)、B(1 mg.kg-1)、AB(5 mg.kg-1) between pre-operation and after operation. The peak of TGF-1 expression was in 2 weeks after operat

5、ion. Each time point in control has the highest expression, where as A+B and MMF group have the lower expressions. CONCLUSION: The results suggest that a medicine down-regulate indirectly TGF-1 expression by inhibiting hyperplasia and infiltration of T、B lymphocytes and macrophage. B medicine plays

6、a protection role for injury caused by oxygen free redical. A+B have the coordinated action which is the same as MMF Key wordsYisheng injection; Abdominal aorta transplantation慢性失功（CAD）是影響移植物長期存活的主要障礙之一，腎移植術后10年，CAD發(fā)生比例仍高達20%30%1。迄今尚無滿意的治療藥物，常規(guī)三聯(lián)免疫抑制劑不能阻止CAD進程。從傳統(tǒng)中醫(yī)藥寶庫中去探索治療CAD的有效藥物具有重要意義。1材料與方法1.1材

7、料雄性封閉群SD與Wistar大鼠(華西醫(yī)大實驗動物中心)各105只，23月齡，體重（20020）g采用腹主動脈移植硬化加快模型（移植段血管缺血24 h），行SDWistar腹主動脈移植。丙二醛試劑盒（100人份，南京建成公司)。TGF-1多抗（130）(北京中山公司)。益生注射液A組分（30 mgml-1）、B組分（20 mgml-1）(成都市藥物制劑研究所)，該注射液是由巖黃連、四棱草、鳳凰爪等多種天然藥物提取而得的靜脈注射液,其有效成分已分別用于臨床，但尚未見用于抗移植慢性失功的報道。術后第一天起，經(jīng)腹腔注射給藥。MMF（每粒500 mg，瑞士羅氏公司）術后第一天起灌胃給藥（20mgkg

8、-1）。1.2方法將受鼠隨機分為I、II、III、IV、V、VI、VII七組，每組15只，分別于術后1周、2周、6周各處死5只，其中I組為空白對照組、VII組為MMF陽性對照組，以上兩組供鼠腹主動脈取下后置04高滲枸櫞酸腺嘌呤液(HCA)保存?zhèn)溆?，II、III、IV、V、VI組分別為A大（6 mgkg-1）、A小（1 mgkg-1）、B大（10 mgkg-1）、B小(1 mgkg-1)、A（3 mgkg-1）+B（5 mgkg-1）給藥組，供鼠腹主動脈取下后分別置于04A大（480 gml-1）、A?。?20 gml-1）、B大（500 gml-1）、B?。?25 gml-1）、A（240 g

9、ml-1）+B（250 gml-1）中保存?zhèn)溆谩?.3標本采集與檢測按觀察時間點切取植入段腹主動脈，石蠟切片，行HE染色，光鏡觀察組織學改變。采用計算機像分析系統(tǒng)，將HE染色結(jié)果經(jīng)光鏡放大400倍后輸入計算機，對像進行灰度換算，自動測出移植的腹主動脈內(nèi)膜、中膜層面積，計算出內(nèi)膜厚度內(nèi)膜厚度=內(nèi)膜面積（內(nèi)膜面積+中膜面積）2。1.3.1過氧化脂質(zhì)（LPO）測定受試鼠術前頸外靜脈插管，分別于術前、術后2、4及24 h抽取靜脈血0.3 ml，肝素抗凝，1500 rmin-1離心10min。取0.1 ml血清，用丙二醛試劑盒在UV-1601PC（日本島津）紫外分光光度儀下測定氧自由基代謝產(chǎn)物之一的丙二

10、醛水平，以反映氧自由基對細胞損傷程度。1.3.2免疫組化檢測轉(zhuǎn)化生長因子1（TGF-1）在移植段血管壁的表達石蠟切片，LSAB法3，由兩名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生光鏡下盲法讀片，按著色程度不同分為0級（無明顯著色），1級（少量著色），2級（中量著色），3級（大量著色）。1.4統(tǒng)計學方法實驗計數(shù)資料結(jié)果均以SD表示，采用SPSSV8.0進行統(tǒng)計分析，P0.05時有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1腹主動脈內(nèi)膜厚度的變化2周時，I組內(nèi)膜厚度為0.2250.120，與術前比明顯增厚，治療組內(nèi)膜增厚不明顯，6周時，VI、VII組內(nèi)膜厚度分別為0.1270.097、0.1280.076，組間無顯著差異（P0.05），

11、而與A組同期（0.2710.087）相比差異顯著（P0.01）(1)。1腹主動脈內(nèi)膜厚度的變化Fig1 Changes in thickness of the endothelium of abdominal aorta2.2腹主動脈組織病理變化正常大鼠腹主動脈，內(nèi)皮細胞扁平，呈單層緊密連接，中膜由46層彈力纖維構(gòu)成，其間散在多量梭形平滑肌細胞（SMC），外膜較薄，由致密結(jié)締組織組成。缺血24 h組SDWistar移植后6周，內(nèi)膜明顯增厚，中膜SMC壞死較重，各層炎細胞浸潤較重。缺血24 h組SDWistar移植，A+B治療后6周，內(nèi)皮細胞稍多，中膜層SMC可見壞死，各層炎性細胞浸潤均較輕。缺

12、血24 h組SDWistar移植，MMF治療后6周，內(nèi)皮細胞稍多，中膜層SMC可見壞死，各層炎性細胞浸潤均較輕。2.3血清LPO變化I、II、III三組術后2 h血清LPO值較術前明顯升高（P0.05），術后4、24h與術前比無明顯變化，使用B組分治療的IV、V、VI組，術后各期與術前比無明顯差別(2)。2血清LPO變化Fig 2 Changes in serumal LPO2.4腹主動脈壁TGF-1的變化各組TGF-1表達高峰均在術后2周，A組各時間點TGF-1的表達最強，、組表達最弱，其余各組介于其間(表1)。表1TGF-1在各組中的表達Table 1 Expression of TGF-

13、1 in each groupGroup1week2week6week0123023012313141122322322122122212122322122124112213131131113321313討論 CAD是免疫因素和非免疫因素共同對移植物的損傷形式，前者指由于組織不相容而導致的對外來抗原的免疫反應，在移植失功中起關鍵作用。后者包括缺血/再灌注（I/R）損傷、巨細胞病毒感染、高脂血癥、術后高血壓、免疫抑制劑的毒性作用等。隨著對CAD機理了解的不斷深入，非免疫因素在CAD中的作用越來越受到重視。Land4等提出理想的免疫抑制劑需具備以下五個標準。對改善患者生存質(zhì)量無負面影響；能有效抑制

14、和防治急、慢性排斥反應；能最大限度降低與CsA相關的腎毒性、感染發(fā)生率及腫瘤發(fā)生率；適用于各種臨床移植；價格合理。目前尚無一種既能逆轉(zhuǎn)急性排斥反應，又能抑制CAD的理想藥物。因此，尋找有效、安全、價廉的防治藥物迫在眉睫。3.1LPO在CAD中的作用血清中LPO由氧自由基氧化細胞膜及血中低密度脂蛋白而來，有顯著致動脈粥樣硬化作用。由于氧自由基對移植物的損傷是I/R損傷的同義詞，隨缺血時間延長，I/R損傷加重LPO值逐漸升高。檢測血清中LPO值可反映I/R對移植物的損傷程度。本研究顯示各組LPO峰值均在術后2小時，提示血管內(nèi)皮細胞損傷高峰發(fā)生在術后2小時，早期抗I/R損傷意義重大。3.2TGF-1

15、在CAD中的作用TGF-1由血小板、T細胞、系膜細胞和單核、巨噬細胞等分泌，具有多向調(diào)節(jié)功能，最終導致細胞外基質(zhì)合成增加，降解減少，刺激SMC增殖、遷移，引起移植物功能不斷惡化5。本研究顯示各組TGF-1高峰均出現(xiàn)在術后2周，此時SMC增殖、遷移明顯，6周時TGF-1表達下降，SMC增殖、遷移減弱。提示早期抗炎治療可能延緩CAD的發(fā)展。3.3MMF的作用6,7MMF通過可逆性抑制次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶，特異性抑制T和B淋巴細胞中的嘌呤經(jīng)典合成途徑抑制淋巴細胞增殖，繼而抑制抗體形成和SMC增生，是目前公認既能抑制急性排斥反應，又能用于治療慢性排斥的藥物。故選作陽性對照。本實驗中見到MMF組術后各

16、時相炎性細胞浸潤均較輕，2周、6周內(nèi)膜增厚也不明顯。3.4益生注射液A組分的作用A組分的有效成份為生物堿，體內(nèi)實驗能明顯抑制小鼠T、B細胞和巨噬細胞活性，具有抗菌消炎，抑制紅細胞溶血等作用。移植段腹主動脈受到I/R損傷后，淋巴細胞、巨噬細胞等炎性細胞浸潤增加，分泌轉(zhuǎn)化生長因子1（TGF-1）并提高SMC上血小板樣生長因子（PDGF）-、受體表達及其對外源性PDGF的反應性，使SMC增殖、遷移，啟動動脈硬化進程8。采用A藥治療后LPO未見明顯下降，但內(nèi)膜增厚及TGF-1的表達較未治療組輕，推測其通過下調(diào)TGF-1的表達而發(fā)揮治療作用，A大作用強于A小，提示作用呈劑量效應關系。3.5益生注射液B組

17、分的作用缺血時由于氧及能量缺乏可導致細胞腫脹，甚至破裂；再灌注更加重受損細胞及白細胞釋放氧自由基及毒性代謝產(chǎn)物，氧化細胞膜及血中的低密度脂蛋白，形成具有很強致動脈粥樣硬化作用的氧化型低密度脂蛋白。B是活血化淤類中藥，能明顯抑制血小板聚集，降低血流粘滯度，促進微動脈血流恢復，改善微循環(huán)。同時對動脈硬化進程中的組胺有明顯抑制作用，并可通過明顯抑制血中及缺血再灌注時組織中氧自由基損傷的主要代謝產(chǎn)物之一的丙二醛（MDA），保護抗氧化酶系統(tǒng)和ATP酶活性，減輕氧自由基對組織的損害。B治療后LPO值于術后2小時未見明顯升高，術后內(nèi)膜增厚及TGF-1的表達均較未治療組輕。B小較B大有效，推測可能因大劑量B對

18、一氧化氮合成酶有輕度的抑制作用；另外大劑量B可減少抗氧化劑如谷胱苷肽的產(chǎn)生。3.6A+B的作用影響CAD的因素眾多，包括免疫因素和非免疫因素，這兩類因素之間有協(xié)同作用。A、B兩藥聯(lián)合使用分別作用于不同環(huán)節(jié)，從不同環(huán)節(jié)打斷CAD的惡性循環(huán)，因而效果較好，其作用與MMF單用相當或略優(yōu)。本研究顯示，A、B、A+B、MMF均可不同程度緩解CAD發(fā)展。A可下調(diào)TGF-1的表達（A大作用強于A小）；B能降低LPO（B小作用強于B大），A+B有協(xié)同作用，其作用與目前公認最好的抗慢排藥MMF單用相當或略優(yōu)，但價格較MMF明顯降低，可望推向臨床。作者簡介： 步宏，男，醫(yī)學博士，副教授，從事移植病理學工作。*現(xiàn)工

19、作單位成都軍區(qū)總醫(yī)院步宏（華西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，四川 成都610041）陳衛(wèi)國（華西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，四川 成都610041）劉于賓（華西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，四川 成都610041）吳大蓉（成都市藥物制劑研究所，四川 成都610072）程驚秋（華西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，四川 成都610041）王莉（華西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，四川 成都610041）參考文獻1，Knechtle S. Chronic rejection: The clinical problem. J.Graft, 1998, 1(2 supple II): 472，Motomura N, Lon H, Maurice

20、 P, et al. Acceleration of arteriosclerosis of the rat aorta allograft by insulin growth factor-1J. Transplantation, 1997, 63(7): 9343，蘇紅，谷代平，胡海霞LSAB法與ABC法免疫組化染色敏感性的對比研究J中國組織化學與細胞化學雜志,1995, 4：2964，Land W. Clinical immunosuppressive matrix in organ transplantationJTransplant Proc.1994, 26:24795.5，Sharma VK, Li B, Ding R, et al. Chronic allograft n