試驗一培養(yǎng)基的配制及滅菌

1、實驗培養(yǎng)基的配制及滅菌培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以 培養(yǎng).分離.鑒定.保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。各類微生物對營養(yǎng)的要求 不盡相同，因而培養(yǎng)基的種類繁多。在這些培養(yǎng)基中，就營養(yǎng)物質(zhì)而言，一般不 外乎碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子及水等兒大類。培養(yǎng)基的配制，一是要求在 營養(yǎng)成分上能滿足所培養(yǎng)微生物生長發(fā)育的需要，二是培養(yǎng)基在使用前不帶菌, 三是以滅菌后和保存過程中營養(yǎng)成分不發(fā)生變化。培養(yǎng)基的滅菌通常在培養(yǎng)基配 制后進(jìn)行，其目的是殺滅培養(yǎng)基中殘存的微生物或活的生物殘體，保證培養(yǎng)基在 貯存過程中不變質(zhì)，也防止其他生物對培養(yǎng)的污染。一. 實驗?zāi)康?.舉握實驗室常用

2、玻璃器皿的清洗.干燥和包扎方法。2.明確培養(yǎng)基的配制原理。3.棠握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。4.了解濕熱和干熱滅菌的原理，并掌握有關(guān)的操作技術(shù)。二. 實驗原理滅菌是指殺滅物體中所有微生物的繁殖體和芽抱的過程。消毒是指用物理、化 學(xué)或生物的方法殺死病原微生物的過程。滅菌的原理就是使蛋白質(zhì)和核酸等生物 大分子發(fā)生變性，從而達(dá)到滅菌的作用，實驗室中最常用的就是干熱滅菌和濕熱 滅菌。干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi) 含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固緩慢。因此，與濕熱滅菌相比，干

3、熱滅菌所需溫度高（160170C）,時間長（l2h）。但干熱滅菌溫 度不能超過1809。否則，包器皿的紙或棉塞就會燒焦，至引起燃燒。高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱, 使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥 中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌器 內(nèi)的壓力，從而使沸點增高，得到高于locrc的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而 達(dá)到滅菌的目的。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。其原因有三：一是 濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫 度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大，

4、三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。這種潛熱, 能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以 提供微生物生長發(fā)育所需的物質(zhì)條件。培養(yǎng)細(xì)菌常用牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基和LB培 養(yǎng)基，培養(yǎng)放線菌常用高氏I號培養(yǎng)基，培養(yǎng)霉菌常用蔡氏培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄 糖培養(yǎng)基（PDA）,培養(yǎng)酵母菌常用麥芽汁培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）o根據(jù)培養(yǎng)目的不同，可分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；此外，還有加富、選擇、 鑒別等培養(yǎng)基之分。就培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)而言，一般不外乎碳源.氮源.無機(jī) 鹽、生長因子及水等兒大類。瓊脂（Agar）只是固體培養(yǎng)基的支持物，一般不為 微生

5、物所利用。它在高溫下熔化成液體，而在45C左右開始凝固成固體。在配制培養(yǎng)基時，根據(jù)各類微生物的特點，就可以配制出適合不同種類微生物生長發(fā)育 所需要的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基除了滿足微生物所必需營養(yǎng)物質(zhì)外，還要求有一定的酸 堿度和滲透壓。霉菌和酵母菌的pH偏酸：細(xì)菌、放線菌的pH為微堿性。所以每 次配制培養(yǎng)基時，都要將培養(yǎng)基的pH值調(diào)到一定的范 ffl。常用微生物培養(yǎng)基的配方如下:咦蛋白腺(Tryptone)10.0 g酵母提取物(Yeast extract)5. 0 g氯化鈉(NaCl)10.0 g瓊脂粉(Agar)20.0 g搖動容器直至溶質(zhì)溶解，用5mol/L NaOH調(diào)pH至，用去離子水定容至在壓

6、力下滅菌20mino牛肉膏蛋白H東培養(yǎng)基配方(pH)：牛肉膏3.0 g族蛋白腺(Tryptone)10.0 gNaCl5. 0 g瓊脂粉(Agar)20.0 g去離子水1000 mL高氏I號培養(yǎng)基配方(pH )：可溶性淀粉20.0 gNaCl0. 5 gKNO51. 0 gK：HP0.,3H：00. 5 gMgSO.7H：O0. 5 gFeS0.7H；00. Olg瓊脂粉(Agar)20.0 gLB培養(yǎng)基配方(pH )：1L,去離子水1000 mL馬鈴薯培養(yǎng)基配方(自然pH)：馬鈴薯(去皮)200. 0 g葡萄糖(或蔗糖)(Dextrose or glucose)20. 0 g瓊脂粉(Agar

7、)20.0 g去離子水1000 mL察氏培養(yǎng)基配方(H然pH)：蔗糖(glucose)30.0 gNaNOs2.0 gK：HP0*1.0 gKCl0. 5 gMgS0,7H：00. 5 gFeS0,7H：00.01 g瓊脂粉(Agar)20.0 g去離子水1000 mLYPD培養(yǎng)基配方(pH )：酵母提取物(Yeast extract)10.0 g蛋白月東(Peptone)20.0 g葡萄糖或蔗糖(Dextrose or glucose) 20. 0 g瓊脂粉(Agar)20.0 g去離子水lOOOraL在壓力下滅菌20raino三. 實驗材料牛肉膏蛋白月東、高氏I號、LB、PDA. YPD.

8、察氏等各種培養(yǎng)基。四. 儀器設(shè)備及用具1.90nim培養(yǎng)皿.吸管、試管、三角瓶.試管刷、硅膠塞、棉花、牛皮紙或報紙、包扎繩、去污粉、洗滌劑、燒杯、量筒、玻棒、牛角匙、pH試紙(pH)、記 號筆、麻繩.紗布等;2.培養(yǎng)基分裝器.天平、電磁爐.微波爐.電爐.石棉網(wǎng)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、立式高圧蒸汽滅菌鍋。五. 試劑無水乙醇、牛肉膏、蛋白腺.馬鈴薯、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白腺(Peptone).咦蛋白腺(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extract)、NaCl瓊脂粉、5mol/L NaOHImol/L HCK KNO3. K：HP0,3H：0 MgSO,7H：O. FeS0,7H：0等。六、

9、實驗步驟1洗滌用試管刷蘸取少量去污粉反復(fù)刷洗器皿23次；用白來水沖洗23次：用 少量去離子水蕩洗12次，控干水分。注意事項:1不能用有腐蝕作用的化學(xué)試劑，也不能使用比玻璃硬度大的物品來擦拭玻 璃器皿；新的玻璃器皿應(yīng)用2%的鹽酸溶液浸泡數(shù)小時，用水充分洗干凈。2用過的器皿應(yīng)立即洗滌。3強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、瓊脂等能腐蝕、阻塞管道的物質(zhì)不能直接倒在洗滌槽內(nèi)，必 須到在廢物缸內(nèi)。4洗滌后的器川1應(yīng)達(dá)到玻璃壁能被水均勻濕潤而無條紋和水珠。2.器皿包扎（1）培養(yǎng)皿：洗凈的培養(yǎng)皿烘干后每5套（或根據(jù)需要而定）疊在一起，用牢固的紙卷成一筒，或裝入特制的不銹鋼桶中，然后進(jìn)行滅菌。（2）吸管：洗凈，烘干后的吸管，在吸口的

10、一頭塞入少許脫脂棉花，以防在使用時造成污染。塞入的棉花量要適宜，多余的棉花可用酒精燈火焰燒掉。每支 吸管用一條寬約45cm的紙條，以3050C的角度螺旋形卷起來，吸管的尖端 在頭部，另一端用剩余的紙條打成一結(jié)，以防散開，標(biāo)上容量，若干支吸管包扎 成一束進(jìn)行滅菌，使用時，從吸管中間擰斷紙條，抽出吸管。（3）試管和三角瓶：試管和三角瓶都需要做合適的棉塞，棉塞可起過濾作用,避免空氣中的微生物進(jìn)入容器。制作棉塞時，要求棉花緊貼玻璃壁，沒有皺紋和 縫隙，松緊適宜。過緊易擠破管口和不易塞入；過松易掉落和污染。棉塞的長度 不小于管口直徑的2借，約2/3塞進(jìn)管口。若干支試管用繩扎在一起，在棉花部 分外包裹油紙

11、或牛皮紙，再用繩扎緊。三角瓶加棉塞后單個用報紙包扎。3.烘干洗凈的儀器控去水分，放在烘箱內(nèi)烘干，烘箱溫度為105noc烘1小時左 右。此法適用于一般儀器。對于急于干燥的儀器或不適于放入烘箱的較大的儀器 可用吹干的辦法。通常用少量乙醇、丙酮（或最后再用乙醯）倒入已控去水分的 儀器中搖洗，然后用電吹風(fēng)機(jī)吹至完全干燥。 不急等用的儀器， 可在蒸ta水沖洗 后在無塵處倒置處控去水分， 然后H然干燥。可用安有木釘?shù)募茏踊驇в型笟饪?的玻璃柜放置儀器。4培養(yǎng)基的配置(1)牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基按培養(yǎng)基配方比例依次推確地稱取牛肉膏、蛋白腺、NaCL放入燒杯中。牛肉 膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱

12、水溶化后倒入燒杯，也可按 在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離, 然后立即取出紙片。蛋白腺很易吸濕，在稱取時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴(yán)防藥品混雜，一 把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。瓶 蓋也不要蓋錯。B、融化在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加 熱使其溶解。將藥品完全溶解后，補(bǔ)充水到所需的總體積，如果配制固體培養(yǎng)基時，將稱 好的瓊脂放入己溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足所損失的水分。C、調(diào)節(jié)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH,如果偏酸，用滴管向 培養(yǎng)基中逐滴加入Imol/L

13、NaOH,邊加邊攪拌， 并隨時用pH試紙測其pH,直至pH達(dá)。 反之， 用Imol/LHCL進(jìn)行調(diào)節(jié)。 對于有些要求pH較精確的微生物， 其pH的 調(diào)節(jié)可用酸度計進(jìn)行。pH不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。配制pH低的瓊脂培養(yǎng)基時，若預(yù)先調(diào)好pH并在髙壓蒸氣下滅菌，則瓊脂因水解 不能凝固。D、過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利某些實驗結(jié)果的觀察。一般無特殊要求的 情況下可以省去（本實驗勿需過濾）。E、分裝按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝人試管內(nèi)或三角饒瓶內(nèi)（見圖3-1）。a液體分裝：分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶容積的一半為

14、宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)用，則根據(jù) 通氣量的要求酌情減圖 1-1 培養(yǎng)基的分裝A漏斗分裝裝置：B自動分裝裝置。1鐵架；2漏斗，3孔膠管；4彈贊夾：5玻璃；6流速調(diào)節(jié)；7裝量調(diào)節(jié)；8開關(guān)少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補(bǔ)加一定量的其他無菌成分，如抗生素等， 則裝量一定要準(zhǔn)確。b固體分裝：分裝試管，其裝量不超過管高的1/5,滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過三角饒瓶容積的一半為宜。C半固體分裝：試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。在分裝過程中，應(yīng)注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引 起污染。F、加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或硅膠塞及試管帽 等

15、），棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基，防止由此而引起的污 染；另一方面保證有良好的通氣性能，使培養(yǎng)在里而的微生物能夠從外界源源不 斷地獲得新鮮無菌空氣。因此棉塞質(zhì)量的好壞對實驗的結(jié)果有著很大的影響。一只好的棉塞，外形應(yīng)象一只蘑菇，大小.松緊都應(yīng)適當(dāng)(見圖3-2)。加塞時的棉 塞的總長度的3/5應(yīng)在口內(nèi)，2/5在口外。圖 1-2 棉塞的制作加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時 冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配 制口期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時容易解 開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱.組

16、別、配制口期。(2)高氏I號培養(yǎng)基配制方法A、稱量和溶化：按配方先稱取可溶性淀粉、放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶 化。然后再稱取其他各成分依次逐一溶化。對微量成分FeSO JHcO可先配成高濃度的貯備液按比例換算后再加入，方法是先在lOOmL水中加入Ig的FeSOt7H：O配成0. Olg/mL,再在lOOOmL培養(yǎng)基中加ImL的mL的貯備液即可。待所有藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，其溶化過程同牛肉膏蛋 白月東培養(yǎng)基配制方法。B、調(diào)pH.分裝、包扎：滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基配制方法。(3

17、) LB培養(yǎng)基配制方法準(zhǔn)確稱量胰蛋白陳(Tryptone) 10g酵母提取物(Yeast extract) 5g氯化鈉(NaCl) lOg放入一饒杯中，搖動容器直至溶質(zhì)溶解，加入1520g瓊脂粉，用5 mol/L NaOH調(diào)pH至，用去離子水定容至1L，分裝，滅菌20raino(4)馬鈴薯培養(yǎng)基配制(PDA)取去皮馬鈴薯200g,切成小塊，放入1500inL的燒杯中煮沸30min,注意用玻 棒攪拌以防糊底。然后用雙層紗布過濾，取濾液加糖（酵母菌用葡萄糖，霉菌用 蔗糖人加熱煮沸后加入瓊脂，繼續(xù)加熱融化并補(bǔ)足失水。再按前所述，進(jìn)行分裝、 加塞、包扎、滅菌20mino（5）察氏培養(yǎng)基配制方法同牛肉膏

18、蛋白腺培養(yǎng)基配制。（6）YPD培養(yǎng)基配制方法同LB培養(yǎng)基配制。5.滅菌（1）高壓蒸氣滅菌A、首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的去離子水，使水面與三角擱架相平為宜。B、放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品（各種玻璃器皿、培養(yǎng)基等）。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸氣流通而影響滅菌效果，三角燒瓶與試管口端均不要與桶 壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透人棉塞。C、加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺拴，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。D、通電加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰5min,以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上徘氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所得壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。E、滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度H然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。(2)干熱滅菌A、裝入待滅菌物品將包好的待滅菌物品(培養(yǎng)川1、試管、吸管等)放入電烘箱內(nèi)，關(guān)好箱門。B、升溫接通電源，撥動開關(guān)，打開電烘箱排氣