上傳人：7***

認證信息

認證類型：個人認證

認證主體：王**（實名認證）

IP屬地：湖北

IP屬地：湖北 上傳時間：2022-01-19 格式：DOC 頁數(shù)：3 大小：19.50KB 積分：15 舉報 版權(quán)申訴

1、局部應用血管內(nèi)皮生長因子基因?qū)Υ笫笃ぐ瓴煌课蛔饔玫膶嶒炑芯?#160;        11-03-11 10:38:00     編輯：studa20                     作者：吳莉，沈江涌，楊美玲，楊桂珍【摘要】  目的局部應用血管內(nèi)皮生長因子基

2、因轉(zhuǎn)染大鼠皮瓣，初步探討其對皮瓣成活率的影響及對皮瓣不同部分促血管作用效果。方法將30只SD大鼠作為實驗模型，隨機分為3組，每組10只，制作背部隨意皮瓣，分別注入脂質(zhì)體包裹的PcDNAVEGF165(目的基因組，實驗組)，PcDNA(空白質(zhì)粒組，對照組)， NS(生理鹽水組，對照組) 。術(shù)后4d斷蒂，斷蒂后7d處死大鼠觀察：(1)各組皮瓣成活率比較。(2)取皮瓣遠端活組織標本行常規(guī)HE染色，檢測平均微血管數(shù)目及內(nèi)徑。(3)取皮瓣遠端活組織標本行VEGF 免疫組化染色觀察VEGF表達情況。(4)取目的基因組皮瓣遠段，中段，近段成活組織標本常規(guī)HE染色，檢測平均微皮瓣血管數(shù)目。結(jié)果目的基因組皮瓣平

3、均成活率明顯高于空白質(zhì)粒組和生理鹽水組兩對照組，平均微血管數(shù)目明顯多于兩對照組，且為管徑較小的新生血管，均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。免疫組化染色強度高于兩對照組。目的基因組皮瓣遠端血管數(shù)目多于近端，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論局部注射VEGF基因后可以增加缺血皮瓣血管新生，提高皮瓣成活率，在皮瓣不同部位促血管增生作用不同。 【關鍵詞】  血管內(nèi)皮生長因子;大鼠;皮瓣研究表明PTEN可以增加MMP-2抑制物TIMP-2的分泌8，TIMP-2可與MMP-2以11形式形成復合物,抑制了MMP-2的活性。許雪峰9等研究MMP-2、PTEN的表達情況，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測兩者

4、可作為判斷賁門癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的客觀指標。在本組資料中二者在食管鱗癌中表達呈負相關(P<0.05)， 隨著食管癌的進展，食管癌組織中MMP-2和表達升高，而PTEN則表達降低，推測PTEN基因可能通過影響MMP-2的表達而影響腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移，影響患者預后但具體的調(diào)控機制有待于進一步研究。AbstractObjectiveTo explore the topical application of vascular endothelial growth factor gene to rat's skin and its effects onflap survival and flap

5、 vascular of the different parts，right flap vascular role of the different parts.Methods30 rats were divided into three groups (n=10). After the model of flap was established in the rats，PcDNAVEGF165 was injected in purpose gene group;PcDNA was injected in bland plasmid group and NS was injected in

6、control group. After flap formed and drug used，the pedicel was devised at 4 days. 7 days after pedicle division，the rats were killed，and then the flap survival rate was measured. The microvessels were study by histological examination. The expression of VEGF was assessed by imunohistochemical staini

7、ng.ResultsThe average flap survival rate of the target gene group was significantly higher than the blank plasmid group and saline group and control group. The average number of blood vessels significantly more than two control groups. And smaller in diameter and angiogenesis (P<0.05). Immunohist

8、ochemical staining was higher than that in two control groups.ConclusionAfter local injection of VEGF gene can increase the angiogenesis of ischemic skin flap to improve flap survival rate，different parts of the flap to promote the role of different angiogenesis.Key wordsVascular endothelial growth

9、factor; Rats; Flap目前應用血管內(nèi)皮生長因子基因轉(zhuǎn)染皮瓣成為該領域研究熱點之一。本實驗將人VEGFcDNA以脂質(zhì)體為載體，皮下注射于大鼠皮瓣，探討其對增加皮瓣成活的影響，及基因在皮瓣不同部位發(fā)揮作用情況，為將其進一步應用臨床進行探索。1材料與方法1.1重組質(zhì)粒的準備:PcDNAVEGF165(華中科技大學同濟醫(yī)學院楊操博士提供)含有VEGF165基因片段，位于BamHI和EcoRI兩個酶切位點之間。將PcDNAVEGF165轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101感受態(tài)細胞，挑選抗氨卞青霉素克隆進行小量快速提取，用BamHI和EcoRI雙酶切鑒定，同時送北京華大生物有限公司進行雙向測序鑒定是否為

10、所要目的基因。將保存的大腸桿菌菌種通過堿裂解法大量提取質(zhì)粒，聚已二醇8000純化。制備的質(zhì)粒經(jīng)核酸，蛋白微量儀測定(美國BIO-RAD公司)定量為12.5g/l,以生理鹽水稀釋為濃度1g/l備用。1. 2脂質(zhì)體的制備與基因包裹：用電子分析天平稱取磷脂酰膽堿(PC,sigma 公司)20mg,膽固醇(Chol,sigma 公司)10mg倒入旋轉(zhuǎn)燒瓶中。用量筒取氯仿60ml,甲醇20ml，倒入高壓滅菌球形旋轉(zhuǎn)燒瓶中溶解磷脂酰膽堿、膽固醇。將旋轉(zhuǎn)燒瓶溫度調(diào)整在70左右，轉(zhuǎn)速為45次/min。待溶液完全蒸干，形成白色光滑膜附著于燒瓶壁，溫度冷卻后加入5ml乙醚，加入40ml含有PCD-VEGF165緩

11、沖液(用生理鹽水稀釋原液至1ml含100g PCD-VEGF165的緩沖液)。在70低轉(zhuǎn)速10轉(zhuǎn)/min洗膜，蒸6min后乙醚基本除盡。將超聲探頭放入液體中，通電5min形成均勻乳白色液，靜置2h不分相。將液體分裝1.0ml(質(zhì)粒100g)在1.5ml高壓滅菌的Eppendorf管中備用。1.3動物分組與皮瓣設計:將30只雄性SD大鼠，體重(350±50g)隨機分成3組：實驗組為目的基因組，兩對照組分別為空白質(zhì)粒組，生理鹽水組，每組10 只。用6.5%水合氯醛(0.05ml/kg)腹腔注射麻醉后，俯臥位固定，背部10%硫化鈉脫毛，清水清洗，0.5%碘伏消毒，鋪單。所有實驗動物在背部以

12、脊柱為中心軸線，設計3cm×9cm的隨意皮瓣，蒂位于髂脊水平。皮瓣在背部肌膜淺面掀起，術(shù)中將皮瓣掀起翻轉(zhuǎn)180度，在皮瓣區(qū)域內(nèi)選取均勻分布的10個點，由筋膜面向皮下用微量注射器分別注入含有VEGF基因的重組質(zhì)粒500g(每點50g)，空白質(zhì)粒500g，生理鹽水組500l(每點50l)。術(shù)后3-0絲線原位縫合，單籠喂養(yǎng)。所有動物均在術(shù)后第4天同法麻醉，斷蒂，必須切斷蒂部血供，間斷縫合。1.4檢測指標:皮瓣成活率：斷蒂后第7d，皮瓣成活與壞死界限明確，將大鼠注射過量麻藥無痛處死，數(shù)碼相機拍照，透明硫酸紙精確描繪皮瓣成活及壞死區(qū)域，稱量紙復錄，電子分析天平稱重，以重量比表示面積比，計算皮瓣成活率(皮瓣成活率=皮瓣成活面積/皮瓣成活面積+皮瓣壞死面積)×100%。平均微血管數(shù)目及內(nèi)徑：取皮瓣組織(正常與壞死交界0.5cm處正常組織即皮瓣遠段)。HE染色，在10×40高倍鏡下隨機選取5個視野，通過醫(yī)學圖文數(shù)字系統(tǒng)軟件計數(shù)微血管數(shù)目，所計數(shù)血管中必須有紅細胞，并同時測量管徑大小，各組計算平均數(shù)。目