蛋白質(zhì)的定量測(cè)定試驗(yàn)報(bào)告

1、蛋白質(zhì)的定量測(cè)定（Folin -酚試劑法）、實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí) 1.0實(shí)驗(yàn)?zāi)康某醪搅私飧鞣N蛋白質(zhì)含量測(cè)定的常用方法。掌握Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理及熟悉和掌握實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。掌握用excel制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)管方法求樣品溶液中待測(cè)定物 質(zhì)含量。1.1實(shí)驗(yàn)原理1.1.1總體概述Folin-酚試劑法是經(jīng)過(guò)科學(xué)家改進(jìn)的測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法，F(xiàn)olin首創(chuàng)這種方法:利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)。而后，Lowry對(duì)此法進(jìn)行了改進(jìn)，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng), 提高了靈敏度，靈敏度的范圍為：20: 250 g，故使得實(shí)驗(yàn)的精確

2、度大大提高，但同時(shí)也存在著干擾物質(zhì)多、費(fèi)時(shí)、操作嚴(yán)格計(jì)時(shí)等問(wèn)題。2在堿性溶液中，雙縮脲（H2NOC NH CONH2）能和Cu作用，發(fā)生配位反應(yīng),形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物，即為雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故在堿性溶液中，蛋白質(zhì)的分子中肽鍵2 2能和堿性銅試劑中的Cu作用，生成紫紅色的蛋白質(zhì)-Cu復(fù)合物。對(duì)于蛋白質(zhì)的測(cè)定 來(lái)說(shuō)，這一步是基礎(chǔ)，這也是Folin-酚法的基礎(chǔ)原理。實(shí)驗(yàn)名稱(TitleofEx perimetn)實(shí)驗(yàn)日期實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)(DateofEx periment)XXXXXXXX合作者XXXX(P artner)總分(TotalScore)(Signature)

3、教師簽名(LabNo.)指導(dǎo)老師XXXX(Instructor)批改日期(Date)1.1.3Foli n-酚顯色反應(yīng)Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易背酚類化合物還原2而呈現(xiàn)藍(lán)色。酪氨酸（Tyr）含有酚羥基，故蛋白質(zhì)-Cu復(fù)合物含有的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。在一定的濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系。故可以利用上述兩種反應(yīng)通過(guò)分光光度法測(cè)定待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量。本實(shí)驗(yàn)以上述兩個(gè)反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，再通過(guò)設(shè)置空白對(duì)照組，標(biāo)準(zhǔn)管中設(shè)置蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的一系列濃度梯度（ONmL,O/mL，OEmL，O.L）通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定吸

4、光 度，從而獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品管通過(guò)測(cè)定的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到較為準(zhǔn)確對(duì)應(yīng) 的含量。1.2實(shí)驗(yàn)材料1血清稀釋液（正常人血清稀釋300倍）200 g/ml牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（BSA）；堿性硫酸銅溶液（組成：堿溶液與硫酸銅溶液按50:1混合而成，使用時(shí)該溶液必須新鮮配制，當(dāng)日有效）；Foli n-酚試劑（配制過(guò)程較為復(fù)雜）注：此次實(shí)驗(yàn)所用的試劑全部已由老師制備好，所以無(wú)配制過(guò)程，但需知道配制流程，可查閱實(shí)驗(yàn)書P 105oV-1100可見光分光光度計(jì);2恒溫水浴箱;3試管6支、試管架;4加樣槍、加樣槍架。管， 利用加樣槍按要求量取相應(yīng)量的溶液,加入Folin-酚試劑水浴10minr(各試管的需

5、加入的試劑和量見卜表)每隔一分鐘，依次往1號(hào)試管到6號(hào)試管中加入2mL的堿性硫酸銅溶液，搖勻并記錄每支試管的加入硫酸銅時(shí)間， 室溫靜置lOmin將靜置時(shí)間達(dá)到lOmin中的試管中，加入0.20mL的Folin-酚試劑，快速搖勻(一般在2s以內(nèi))。(3)Folin-酚反應(yīng)在400C下水浴加熱lOmin鐘同樣需計(jì)時(shí)。10min鐘后取出冷卻至室溫。轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)旋鈕，調(diào)制500.0nm,按“mode鍵切換到T檔,分別將1-6號(hào)試管中混合液放入比色杯中利用1號(hào)試管為空調(diào)至A檔，依次測(cè)定2-6試管的吸光度，并讀取數(shù)據(jù)。重復(fù)操作，再讀取數(shù)據(jù)2次，并記錄。數(shù)據(jù)表格見表1利用測(cè)得的數(shù)據(jù)，繪制以A500值為縱坐標(biāo)，牛

6、血清清蛋白標(biāo)(5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)的準(zhǔn)備曲線，具體繪制利用excel制作,1.3實(shí)驗(yàn)步驟-溶液混合步驟滴加堿性硫酸銅作I_靜置10min*繪圖取結(jié)果(1)反應(yīng)體系設(shè)置123456牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液00.20.40.60.80樣品液000000.5蒸餾水1.00.80.60.40.20.5(2)雙縮脲反應(yīng)(4)比色測(cè)定白，校置100；結(jié)果可見圖2根據(jù)樣品管（6管）的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)（300），得出每毫升未稀釋血血清蛋白濃度（g/ml）=樣品蛋白質(zhì)濃度X 2 X 300參考：正常人血清蛋白濃度范圍為6080 g/L。1試劑要求：實(shí)驗(yàn)所需的試劑必

7、須是新鮮配制，不然會(huì)存在被空氣及其他物質(zhì)氧化還原的情況，干擾實(shí)驗(yàn)的測(cè)定。2控制時(shí)間：Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟的操作，規(guī)定的時(shí)間是多少就多少。水浴時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)。同時(shí), 在最后從水浴加熱后取出冷卻后，需及時(shí)的進(jìn)行比色測(cè)定。防止混合液中物質(zhì)發(fā)生系列 變化和反應(yīng)。3加入Folin-酚試劑后，需要馬上混合搖勻，防止磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞。干擾物質(zhì)的影響：凡干擾雙縮脲反應(yīng)的基團(tuán)，均可干擾Folin-酚反應(yīng)。這些物質(zhì)在所測(cè)樣品中含量較高時(shí)，則需做校正曲線。若所測(cè)的樣品中含硫酸銨，則需增加 碳酸鈉一氫氧化鈉濃度即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，也需提高

8、碳酸鈉一氫氧化鈉濃 度12倍，這樣即可糾正顯色后色淺的弊病。5繪制曲線要求：作過(guò)原點(diǎn)的直線或光滑連續(xù)的曲線，該線表示實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的平均變動(dòng)情況，因此該線不需全部通過(guò)各點(diǎn)，但應(yīng)盡量使未經(jīng)過(guò)線上的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均勻分布在曲線或直線兩側(cè)。（電腦Excel繪圖，可以不考慮）、實(shí)驗(yàn)記錄（6）測(cè)樣品蛋白清含蛋白質(zhì)的微克數(shù)，即每毫升血清中蛋白質(zhì)的微克數(shù)質(zhì)含量(mg/ml)。操作要按照實(shí)驗(yàn)步驟,步一步來(lái)，防止操作問(wèn)題導(dǎo)致的操作誤差的出現(xiàn)等。2.1實(shí)驗(yàn)條件材料及試劑：本次實(shí)驗(yàn)的試劑和材料均是實(shí)驗(yàn)室配制好的，比例和濃度同實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí),故不再贅述。實(shí)驗(yàn)時(shí)間表:總表實(shí)驗(yàn)步驟消耗時(shí)間混合溶液未計(jì)時(shí)滴加溶液靜置10mi n加Folin-酚

9、試劑、水浴10mi n室溫冷卻27min等待20min比色測(cè)定6mi n附表項(xiàng)目時(shí)刻表試管1試管2試管3試管4試管5試管6加硫酸銅842”09843”20844”29845”45846”55847”55水浴852”09853”20854”29855”45856”55857”55冷卻等待902”09903”22904”29905”45906”55908”00操作技巧:1在這一次的實(shí)驗(yàn)中，關(guān)鍵的要點(diǎn)在于滴加Folin-酚試劑的搖勻，必須快速搖勻，保證 反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行。振蕩試管時(shí)，振蕩的正確方法是用手腕的力左右擺動(dòng)，使試管中液體混 合均勻且不漏出。最后放入到水浴中加熱。2在分光比色的時(shí)候，測(cè)量一次后重

10、新凋零，不能繼續(xù)測(cè)量等。操作失誤:全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，就出現(xiàn)了一次失誤，即在試管4加入Folin-酚試劑，充分搖勻，在放入水浴加熱之間，部分液體由于磕碰而濺出。其余操作嚴(yán)格按照要求一步步完成，理論 不存在著失誤。分析：Folin-酚與液體已經(jīng)混合均勻并反應(yīng)，在后面的水浴加熱后，只是影響到了整體 的試管4的反應(yīng)后得到的溶液量，而不影響顏色的變化及最后的比色測(cè)定，故該失誤不 會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生測(cè)定的偏差。2.2實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象1在滴加硫酸銅溶液后，搖勻，產(chǎn)生較多的黏性氣泡且附著在液體表面。液體顏色變化 不深。2在滴加Folin-酚試劑水浴加熱后，除試管1為淡黃色外，其余試管均成不同的藍(lán)色。具體看下圖:圖一水浴后各試

11、管的情況圖分析：標(biāo)準(zhǔn)液的試管中（2-5）藍(lán)色不斷加深，同實(shí)際的標(biāo)準(zhǔn)液的含量多少正相關(guān)，而 試管6的顏色不深，在1-2試管之間，根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理初步可以判定的是：該樣品液的蛋 白質(zhì)含量將不會(huì)在60-80g/L之間，而是在0-40g/L。即實(shí)驗(yàn)存在一定的問(wèn)題，詳見結(jié)果 的分析與討論。2.3實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)本次實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)是在500nm的波長(zhǎng)下，各試管混合液的吸光度值，結(jié)果見下表1表1500nm波長(zhǎng)吸光度值記錄各管吸光度值A(chǔ)500測(cè)定次數(shù)0.3530.5610.7440.9380.172各管平均值A(chǔ)500、結(jié)果與討論3.1數(shù)據(jù)處理A500=(0.353+0.350+0.351)/3=0.3513；A500=

12、(0.561+0.562+0.562)/3=0.5617；依次得到4-6管的吸光度值如下所示:測(cè)定次數(shù)-各管吸光度值A(chǔ)50023456各管平均值A(chǔ)5000.35130.56170.74370.93800.17203.1.2Excel繪制蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線PPt所示步驟，最終得到如下結(jié)果:圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2從圖中我們可以看到線性方程：y 0.0062 ?x，R0.9659故得血清蛋白濃度為16.65g/L03.2結(jié)果由上數(shù)據(jù)處理可知，最后的待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量為16.65g/L0而真正的正常人血清0.3500.5620.7440.9380.1720.3510.5620.7

13、430.9380.1723.1.1利用原始數(shù)據(jù),可得到各管的平均值:2管:3管:將樣品溶液的吸光度（即y值）代入方程,可得出樣品濃度（即x值）；由相關(guān)指數(shù)值R2可看出誤差大小。y 0.1720 x 0.17200.006227.74 g/mL血清蛋白濃度（g/ml）=樣品蛋白質(zhì)濃度X2X 300蛋白濃度范圍為6080g/Lo因此，存在一定問(wèn)題，具體分析見3.3分析與討論。3.3分析與討論首先，我們回顧了整個(gè)操作過(guò)程，在整個(gè)過(guò)程中，我們基本都是按照要求操作，并不存 在著明顯的操作問(wèn)題。通過(guò)上面水浴加熱后的圖可以明顯看到， 結(jié)果的確應(yīng)該在0-20g/L之間。同時(shí)我們與和我們一樣使用試劑的組討論后發(fā)

14、現(xiàn)，他們的結(jié)果也是在10幾左右;同時(shí)，很多組測(cè)出的結(jié)果都偏低，故可以初步判定結(jié)果的測(cè)量方式上不存在明顯問(wèn)題。其次，回顧全部過(guò)程的原理，我們猜測(cè)可能存在的造成結(jié)果低的情況為:1在室溫冷卻后，實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有空余的分光光度計(jì)，排隊(duì)時(shí)間應(yīng)該是全部小組中最長(zhǎng) 的，基本花去30多分鐘。而這也導(dǎo)致了最后的顯色增強(qiáng)（其具體的顯色原因可能為物 質(zhì)間的復(fù)雜反應(yīng)導(dǎo)致）從而使得最后的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率增大，導(dǎo)致測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)的樣品液蛋白質(zhì)含量的下降。即AB，如圖所示:3開始實(shí)驗(yàn)的試管清洗的不充分B可能存在部分的雜質(zhì)，導(dǎo)致顯色反應(yīng)的增強(qiáng)。4分光光度計(jì)的幾個(gè)比色杯透明面被碰到， 影響到了液體的吸光度，吸光度的下降, 使得樣品液的測(cè)定

15、值偏低。最后，有可能在以后的時(shí)間里，可以重新做該實(shí)驗(yàn)，從多方面來(lái)驗(yàn)證自己的分析。多和老師同學(xué)交流，得到較好的結(jié)果3.4復(fù)習(xí)思考題參考資料來(lái)源:生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).王曉華，朱文淵主編1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點(diǎn)?答:根據(jù)所學(xué)及所查知識(shí)，優(yōu)點(diǎn)總結(jié)如下:分光光度計(jì)的比色杯清斛析不干凈，存在蒸餾水的色反應(yīng)增強(qiáng)后的的總體效效果是使樣品液的含量測(cè)定下降品液吸光值原本的標(biāo)準(zhǔn)曲測(cè)定蛋白質(zhì)靈敏度高，較為準(zhǔn)確，可檢測(cè)最低蛋白質(zhì)量達(dá)5 g，通常范圍為:20: 250 g在生物化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。2操作雖受時(shí)間限定，但是只需加入兩種試劑，即可起作用，總體上說(shuō)，操作簡(jiǎn)單，原 理清晰易懂。3適用性廣，除測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，還可特定的適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。2、應(yīng)用本方法有哪些干擾作用？為什么？應(yīng)如何注意?答:對(duì)雙縮脲反應(yīng)有干擾的離子，同樣干擾Lowry反應(yīng)，且影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。原因是：Lowry反應(yīng)的第一步即