非諾貝特對高糖培養(yǎng)腎小球系膜細胞胞外基質(zhì)產(chǎn)生及降解影響

1、非諾貝特對高糖培養(yǎng)腎小球系膜細胞胞外基質(zhì)產(chǎn)生及降解影響                      作者：倪連松，金潔娜，鄭景晨，沈飛霞 【摘要】  目的 ：探討非諾貝特對糖尿病腎病的保護機制。方法：大鼠腎小球系膜細胞分別培養(yǎng)在正常糖濃度（5.5 mmol·L-1，對照組）、高糖濃度（25 mmol·L-1，高糖組）及25 mmol·L-1葡萄糖+非

2、諾貝特100mol·L-1（非諾貝特組）。CCK-8測定系膜細胞增殖；ELISA法檢測培養(yǎng)上清液型膠原(Col-)、纖維連接蛋白(FN)、轉(zhuǎn)化生長因子-1(TGF-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)；明膠酶譜法檢測培養(yǎng)上清基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9(MMP-2，9)的活性。結(jié)果 ：高糖組系膜細胞較對照組出現(xiàn)增殖增加，合成基質(zhì)蛋白Col-，F(xiàn)N增多，MMP-2及MMP-9活性下降，TIMP-1含量增加，TGF-1分泌增加。與高糖組比較非諾貝特干預后能完全或部分逆轉(zhuǎn)上述變化。結(jié)論 ：非諾貝特能抑制高糖培養(yǎng)的系膜細胞增殖，減少胞外基質(zhì)合成，增加胞外基質(zhì)的降解。 【關(guān)鍵詞】&#

3、160; 糖尿病腎病；非諾貝特；腎小球系膜細胞Abstract:   Objective: To explore the protective mechanism of fenofibrate on diabetic nephropathy. Methods: Rat mesangial cells (MC) were incubated in media containing 5.5 mmol·L-1 glucose （control group），25 mmol·L-1 high glucose (HG group) and 25 mmol·

4、;L-1 glucose+100mol·L-1 fenofibrate (FB group). Cellular proliferation was assessed with CCK-8. Fibronectin (FN)， type collagen (Col-)，transforming growth factor-1 (TGF-1) and matrix metalloproteinase inhibitor-1(TIMP-1) in supernatant were detected with ELISA method. Activities of matrix metal

5、loproteinase-2，9 (MMP-2，9) in supernatant were detected with gelatinase zymography. Results: Compared with control group， MC in HG group showed a high growth rate and synthesis of Col-and FN were increased ；activities of MMP-2 and MMP-9 decreased，and secretion of TGF-1 and TIMP-1 increased. Compared

6、 with HG group， these changes could be fully or partly reversed by fenofibrate treatment. Conclusion: Fenofibrate can inhibit high glucose-induced proliferation of mesangial cells， decrease synthesis of extracellular matrix， and increase degradation of extracellular matrix. Key words: diabetic

7、nephropathy；fenofibrate；mesangial cells過氧化物酶體增殖體激活受體(PPARs)是一種配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體基因家族。PPARs包括PPAR，PPAR和PPAR三種亞型。最近人們發(fā)現(xiàn) PPAR在腎臟疾病治療中是一個新的靶點1。PPAR可通過對單核巨噬細胞的影響而發(fā)揮其強大的抗炎作用， 因此PPAR活性改變可能參與腎臟炎癥反應(yīng)過程1。貝特類藥物可通過激活PPAR，調(diào)整其在腎臟的表達，從而降低腎血管性腎炎、腎血管性硬化癥及糖尿病腎病等腎病的發(fā)生1。目前，有關(guān)貝特類藥物對糖尿病腎病保護作用的研究還很少見。為進一步證實貝特類藥物對糖尿病腎病的保護作用，我們

8、擬觀察非諾貝特（FB）對高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞增殖及其分泌細胞外基質(zhì)成分（IV型膠原、纖連蛋白）的影響，并同時檢測其對轉(zhuǎn)化生長因子-1（TGF-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)的影響，以探討其作用機制，并為其進一步的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。1  材料和方法1.1  材料 大鼠腎小球系膜細胞（MC）為武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心的大鼠腎小球系膜細胞EC(HBZY-1)，CCTCC編號：GDC124。非諾貝特（Fenofibrate，F(xiàn)B）購自徐州恩華藥業(yè)集團有限責任公司（產(chǎn)品批號：20050501）。CCK-8試劑盒購購自

9、日本同仁化學研究所，DMEM培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為天津正江公司產(chǎn)品。分光光度儀為Backman DU460。酶標儀為美國Bio-tek Instruments ELX 800。IV型膠原（Col-IV）ELISA檢測試劑盒、TIMP-1 ELISA檢測試劑盒、TGF-1 ELISA檢測試劑盒購自美國Bionewtrans Pharm-aciutical Biotechnology公司，纖連蛋白（FN）ELISA檢測試劑盒購自大連泛邦化工技術(shù)開發(fā)有限公司（日本進口分裝）。     1.2  方法1.3  統(tǒng)計學處理方法&

10、#160;組間差異用單因素方差分析，有顯著差異者用LSD-t檢驗進行兩兩比較，組內(nèi)不同時間比較用兩樣本t檢驗。2  結(jié)果2.1  FB對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞增殖的影響 與對照組相比，24、48及72 h HG組的細胞存活都有顯著增高，提示高糖可明顯促進MC增殖。非諾貝特干預明顯抑制高糖的促增殖作用，且與HG組比較差異均有顯著性(24、48及72 h)（見表1）。2.2  FB對高糖培養(yǎng)系膜細胞上清液中基質(zhì)蛋白表達的影響 表2結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖刺激24 h與48 h可增加MC上清液中FN的合成。FB干預24 h與48 h后對高糖刺激

11、的FN的合成都有明顯的抑制作用，可接近對照組水平。與對照組相比，在實驗24 h與48 h，高糖都可刺激MC上清液中Col-IV的合成。FB干預24 h對高糖刺激的Col-IV合成的抑制作用不明顯，但干預48 h則對COL-IV合成有較明顯的抑制作用。2.3  FB對高糖培養(yǎng)系膜細胞上清液中TGF-1及TIMP-1蛋白含量的影響 表3結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖在24 h和48 h都可刺激TGF-1的合成；FB干預24 h及48 h后對高糖刺激的TGF-1合成都有顯著的抑制作用。與對照組相比，高糖在24 h和48 h都可刺激TIMP-1的合成；FB干預24 h及48 h后對高

12、糖刺激的TIMP-1的合成有明顯的抑制作用，可達接近對照組水平。2.4  FB對高糖培養(yǎng)系膜細胞上清液中MMP-2及MMP-9活性活性的影響  見圖1所示，明膠酶譜電泳后發(fā)現(xiàn)凝膠上出現(xiàn)3條透明條帶，其中92 kD為MMP-9相應(yīng)條帶，72 kD為MMP-2酶原相應(yīng)條帶（pro-MMP-2），64 kD為MMP-2活化形式相應(yīng)的條帶。MMP-2表達強于MMP-9，且MMP2以活性形式為主。表4結(jié)果顯示，與對照組相比，24 h及48 h高糖刺激下上清液中MMP-2和MMP-9均顯著減少，組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)含量在各時間點變化不明顯。FB干預24 h及48 h后MMP-2和MMP-9活性

13、明顯增強，但均未達到低糖組水平。     3  討論細胞外基質(zhì)(ECM)代謝的失平衡（合成增多，降解減少）是糖尿病腎?。―N）形成的關(guān)鍵性因素。Col-IV與FN是構(gòu)成ECM的主要結(jié)構(gòu)蛋白。我們發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)可明顯促進MC增殖，并對系膜細胞分泌Col-IV和FN有顯著的促進作用，這一點同諸多報道一致2-3?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是ECM主要的降解酶之一，其中起作用的主要是MMP-2及MMP-9?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑是MMPs天然的特異性抑制因子，在腎臟中起作用的主要為TIMP-1。我們的研究發(fā)現(xiàn)高糖刺激會促使系膜細胞MMP-2及MMP-9表達

14、顯著下降，而TIMP-1表達升高。這揭示了高糖不僅可以通過下調(diào)MMPs的基因表達而減少其對ECM的降解，同時可通過增加TIMP-1表達而抑制MMPs酶的活性，最終加速FN、Col-IV等細胞外基質(zhì)的沉積。TGF-1既可刺激ECM蛋白質(zhì)合成，又可降低ECM降解酶的活性，從而引起基質(zhì)蛋白沉積。近年來，TGF-1已被認為是MMPs/TIMP系統(tǒng)最重要的調(diào)控因子4。本研究發(fā)現(xiàn)高糖在導致ECM分泌增加、MMPs/TIMP系統(tǒng)的紊亂同時，也引起TGF-1蛋白分泌的增加，因此ECM的累積及降解減少可能與TGF-1介導有關(guān)。貝特類降脂藥物是最先發(fā)現(xiàn)的PPAR合成配體，目前臨床使用的有氯貝特、苯扎貝特及FB等。

15、此外，除了對脂代謝的影響外，尚可起到抗炎及抗動脈硬化的作用5。Park等6報道16周PPAR基因敲除的糖尿病小鼠較野生型糖尿病小鼠有著更為嚴重的微量白蛋白尿、腎小球硬化及系膜基質(zhì)的擴張；體外研究還顯示FB可明顯下調(diào)高糖培養(yǎng)腎小球系膜細胞Col-IV及TGF-1的合成。Park等7還發(fā)現(xiàn)FB能顯著改善db/db小鼠的高血糖、胰島素抵抗、尿微量白蛋白及腎小球纖維化。Chen等8報道FB通過下調(diào)TGF-1及纖溶酶原激活物抑制物-1的表達而顯著改善STZ誘導的Wistar大鼠糖尿病腎病的進展。也有臨床研究表明，F(xiàn)B治療3年可顯著減少2型糖尿病患者微量白蛋白尿的進展9。我們的研究表明，F(xiàn)B干預除了能明顯

16、減少高糖培養(yǎng)的系膜細胞Col-IV，F(xiàn)N的合成外，還可上調(diào)MMP-2及MMP-9的表達及減少TIMP-1的分泌，從使MMPs/TIMP-1比值升高，說明了FB干預確實能有效減輕ECM的積聚，延緩腎小球硬化。同時我們也發(fā)現(xiàn)FB能顯著降低促纖維化因子TGF-1的表達，提示了FB對MMPs/TIMP系統(tǒng)的影響可能部分是通過阻斷TGF-1來介導的?！緟⒖嘉墨I】  1Varghese Z, Moorhead JF, Ruan XZ. The PPARalpha ligandfenofibrate: meeting multiple targets in diabetic nephropa-th

17、y J. Kidney Int, 2006, 69(9): 1511-1517. 2Koya D, Haneda M, Nakagawa H, et al. Amelioration ofaccelerated diabetic mesangial expansion by treatment witha PKC beta inhibitor in diabetic db/db mice, a rodent modelfor type 2 diabetesJ. FASEB J, 2000, 14(3): 439-447.3Park IS, Kiyomoto H, Abboud SL, et a

18、l. Expression of trans-forming growth factor-beta and type IV collagen in earlytreptozotocin-induced diabetes J. Diabetes, 1997, 46(3):473-480.4Border WA, Noble NA. Evidence that TGF-beta should be atherapeutic target in diabetic nephropathyJ. Kidney Int,1998,54(4):1390-1391.5Staels B, Fruchart JC. Therapeutic roles of peroxisomeproliferator-activated receptor agonists J. Diabetes, 2005,54:2460-2470.6Park CW, Kim HW, Ko SH