微生物來源的醛糖還原酶抑制劑的研究進展

1、微生物來源的醛糖還原酶抑制劑的研究進展<    【關鍵詞】   醛糖還原酶抑制劑； 糖尿病并發(fā)癥； 微生物來源    ABSTRACT  Diabetic complications is related to the activation of polyalcohol pathway. Aldose reductase is a key ratelimiting enzyme in the pathway, while aldose reductase inhibitors can inhibit

2、 the pathway and alleviate the symptoms of diabetic complications. This review mainly gives a brief account of the progress of research on aldose reductase inhibitors from microorganisms.    KEY WORDS  Aldose reductase inhibitors;  Diabetic complications;  Microbial ori

3、gin    糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種多病因的代謝性疾病，其特征之一就是葡萄糖代謝異常和某些 組織 中高血糖狀態(tài)。1995年，世界衛(wèi)生組織 統(tǒng)計 全世界糖尿病在成人中發(fā)病率為4%，預計在2025年將達到8%1。盡管可以用胰島素對糖尿病患者進行 治療 ，但還是會留下危及許多組織和器官的糖尿病并發(fā)癥(diabetic complications)，如糖尿病性白內障、動脈粥樣硬化、周圍神經疾病、腎臟病變和視網膜病變等2。糖尿病并發(fā)癥不僅威脅人類健康和生命安全，降低生活質量，而且?guī)沓林氐?經濟 負擔。    

4、 1  醛糖還原酶與糖尿病并發(fā)癥     現(xiàn)有的大量研究表明，多元醇通路激活是繼發(fā)性糖尿病并發(fā)癥主要原因。糖尿病并發(fā)癥與糖代謝的多元醇通路(圖1)激活有關。 多元醇通路由醛糖還原酶圖1    多元醇通路         AR是多元醇通路的關鍵限速酶，在正常血糖濃度時AR并不被激活，活性不高，代謝率極低，但如血糖濃度超過正常生理水平，催化葡萄糖轉化為6磷酸葡萄糖的己糖激酶被飽和，AR將被激活，葡萄糖的代謝速率增加24倍，促使體內的葡萄糖轉化成山梨醇

5、。但山梨醇脫氫酶的活力并未呈比例地相應增加，山梨醇又由于自身極性大而不易通過細胞膜，所以在細胞內造成了山梨醇的蓄積，造成細胞滲透性水腫，改變細胞膜的通透性，同時細胞內山梨醇大量蓄積也可使Na+、K+ATP酶活性下降，細胞中肌醇流失，導致細胞代謝與功能的損害，出現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥等器官病變。    通過抑制AR的活性能減少山梨醇的生成，有效防止和改善糖尿病并發(fā)癥，所以，通過以AR為靶點醛糖還原酶抑制劑(aldose reductase inhibitors，ARIs)的篩選研究 工作 ，成為糖尿病并發(fā)癥治療藥物開發(fā) 熱點 。     2&#

6、160; ARIs篩選模型的研究     任何藥物的開發(fā)都離不開一個有效的篩選模型。針對AR為靶點的ARIs篩選，分為體內篩選和體外篩選，體內篩選是利用動物模型進行篩選，而體外篩選分為無細胞相水平篩選和細胞相水平篩選。    實驗中的AR主要來源于大鼠、牛、豬、人和兔。1965年，Selma等首次從小牛的晶狀體中分離到AR，并對AR的制備、活性測定及性質作了詳細的闡述。該法是取小牛晶狀體，經勻漿、離心后，上清中加入不同濃度的硫酸銨溶液去雜質，最后加75%硫酸銨飽和溶液，得到粗酶制品，再經透析、DEAEcellulose柱層析獲得純品。

7、后來又制備了不同動物來源的AR，方法大多類似。    糖尿病動物模型是最早用來篩選ARIs的模型，目前廣泛 應用 的是體外篩選模型。體外篩選模型是先培養(yǎng)糖尿病動物模型即四氧嘧啶(alloxan)誘導模型和鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導模型，而后取血，體外測定AR的活性變化，作為評價ARIs的重要指標。測定紅細胞中AR活性的方法有分光光度法、熒光法和ELISA法。利用無細胞相水平篩選ARIs是直接用純化的AR在人工反應體系中測定化合物對AR活性的抑制作用。    應用96孔石英板成功建立的ARIs的微量高效篩選模

8、型，較傳統(tǒng)的石英比色皿法效率提高10倍之多，此模型簡便易行、成本低，可以篩選多來源的化合物，并且利用此模型開展了從生物產物中篩選ARIs的工作，已累計篩選真菌和稀有放線菌樣品1500個，其中陽性樣品6個，說明該模型有效5。閆泉香等6利用體外細胞培養(yǎng)研究了黃酮類ARIs的活性，通過測定樣品對紅細胞山梨醇生成的影響來測定化合物的抑制作用。通過組織貼塊法培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細胞，高效液相色譜測定反應體系中反應后剩余的醛糖還原酶的輔酶NADPH的熒光強度，推算出反應體系中醛糖還原酶的活性，逆轉錄聚合酶鏈式反應(RTPCR)檢測醛糖還原酶mRNA的表達，這種方法簡便、可靠，既可以用于高通量ARIs篩選，

9、也可在此模型的基礎上進行相關的藥物篩選以及藥物作用機制的研究7。劉英華等8從大鼠晶狀體中提取AR，通過改變酶促反應條件最終確立整個反應體系的組成，建立了ARIs篩選模型，并利用此模型檢測槲皮素對AR的抑制作用。     3  微生物來源的ARIs     ARIs來源主要有：由化學合成制備，主要代表有托瑞司他(tolrestat)和依帕司他(epalresta)；從植物篩選得到，代表化合物槲皮素；從微生物篩選得到。從微生物的代謝產物中尋找有潛在治療價值的藥物，一直是科研工作者的首選目標，ARIs也不例外，在這一方面，日本學者

10、做了許多研究，取得了一定的成績。截止目前，已從微生物產物中篩選出20多種ARIs，并且有的ARIs的IC50值很小，主要來源于真菌和放線菌，而細菌來源的目前尚沒有相關報道。    微生物是化合物多樣性的重要來源，它們中許多具有生物活性或藥用特性。微生物來源的潛在ARIs種類豐富，建立ARIs化合物庫，分析其構效關系，找到必需基團，可為ARIs化合物提供合成的前體；從目前已分離到的微生物來源的ARIs出發(fā)，找出它們共有的特征，也可啟發(fā)人們設計更高活性的ARIs。以下就近年來從微生物來源中所得到的ARIs的種類及活性(體外測定)研究做一概括的介紹。 

11、0;  最早從微生物中得到ARIs是Nishikawa等9報道的，他們在日本福崗地區(qū)土壤中篩選到真菌Chaetomella raphigera，從其發(fā)酵液乙酸乙酯部分分離得到WF3681(2，圖2)對兔晶狀體AR具有抑制活性，其IC50為0.25mol/L，活性明顯高于IC50為0.42mol/L的索比尼爾對照樣品；后來合成出WF3681的一系列衍生物，并且分析了構效關系，實驗證明WF3681及其衍生物均能抑制糖尿病大鼠中的山梨醇積累，其中的一種衍生物(3，圖2)效果最好。    Aldostatin(5，圖2)是從日本土壤中篩選到的真菌Pseudeur

12、otium zonatum M4107代謝產物，對牛晶狀體AR有抑制活性11。后來從灰色腐質霉Humicola grisea的代謝物中篩選到一種Aldostatin結構類似物WF2421(6，圖2)，這種類似物對兔晶狀體AR有顯著的抑制作用，其IC50為0.03mol/L12。    從Crucibulum sp. RF3817的發(fā)酵產物中分離得到對鼠晶狀體醛糖還原酶(RLAR)顯示較強抑制的活性物質Salfredins A3、A4、A7、C1、C2、C3和B11等7種化合物，其中A4、B11(7、8，圖2)活性較高，進一步研究發(fā)現(xiàn)它們都含有一個甘氨酸基團，此基團

13、與抑制活性有密切相關13。    在青霉屬的Penicillium citrinum發(fā)酵液中分離得到對RLAR有抑制作用的桔霉素(9，圖2)；此外，在另一種青霉屬的P.corylophilum也分離到對RLAR有抑制作用的化合物DHMI(10，圖2)，它們的IC50都在10mol/L左右。以這兩種化合物為基礎的衍生物已被合成和進一步研究，其中之一的dihydrocitrinin(11，圖2)是對AR的一種不可逆抑制劑，并且有穩(wěn)定有效的活性14。最近Lu等15從海洋真菌Penicillium    圖2   

14、; 微生物來源的部分ARIs化學結構式citrinum B57中也分離到桔霉素衍生物，對RLAR的IC50為0.8mol/L。    Yoshida等16從真菌屬的Chaetomella circinoseta代謝產物中分離得到了對RLAR有抑制作用的化合物(12，圖2)，其IC50為0.016mol/L，效果明顯好于IC50為0.027mol/L的對照組托瑞司它。    從嗜堿棒狀桿菌Corynebacterium sp.發(fā)酵液中分離得到的YUA001(13，圖2)對豬腎AR的抑制活性IC50為1.8×10-3mol/L1

15、7。強翔等18應用ARIs微量高效篩選模型對數(shù)千株陽性菌株進行篩選，其中灰色鏈霉菌SIPI99807的代謝產物5，7二羥基3(4羥基苯酚)4氫1苯并吡喃4酮(14，圖2)對牛眼晶狀體AR有抑制活性。后來，任曉等19從云南篩選得到N99253菌株，發(fā)酵分離獲得了結構類似物質異黃酮類化合物7(L鼠李糖基)5羥基3(4羥基苯酚)4氫1苯并吡喃4酮(N99253B)(15，圖2)，針對豬晶狀體AR活性測定IC50為75g/ml19。    2002年Rao等20從黑曲霉Aspergillus niger CFRW105菌株代謝產物中分離得到nigerloxin(16，圖2

16、)，它對RLAR的IC50值為69mol/L。2003年Rao等21又從Aspergillus niger CFR1046菌株的發(fā)酵產物中分離得到asperaldin，對AR顯示較強的抑制作用，IC50為27mol/L。    Fujita等22從曲霉Aspergillus sp.HK388的發(fā)酵液中分離出對人重組體AR(HRAR)呈抑制活性的黃酮類化合物8羥基黃豆苷元(8hydroxydaidz Ei n)(17，圖2)，其IC50為4.2mol/L；對照品為一種常用黃酮類物質槲皮素，其IC50為2.7mol/L，活性弱于槲皮素，8羥基黃豆苷元表現(xiàn)為非競爭性抑制

17、。研究發(fā)現(xiàn)，與8羥基黃豆苷元結構類似的物質黃豆苷元在100mol/L時對HRAR也不能表現(xiàn)出任何活性，從結構上發(fā)現(xiàn)可能是在環(huán)上的鄰二羥基決定其是否有活性。    2005年Dong等23從云南土壤的Streptomyces diannanensis中分離出了兩種異黃酮鼠李吡喃糖苷類化合物N99596A和B(18、19，圖2)，它們對AR的體外IC50分別為170和165mol/L。    2006年任曉等24利用高通量ARIs篩選方法，從數(shù)千株放線菌和真菌中篩選得到陽性菌株鄔氏黃絲曲霉(Talaromyces wortmannii)，并從發(fā)酵產物中分離得到活性化合物F01195A(20，圖2)，其對豬晶狀體有抑制作用，IC50為57.2mol/L。Chidananda等從青霉屬的Penicillium frequentans發(fā)酵液中分離得到一種有效的ARIs核叢青霉素(21，圖2)，對RLAR的IC50為0.4mol/L，其活性顯著高于同一實驗室的所發(fā)現(xiàn)的ARIsnigerloxin和asperaldin20，21，25。    最近，有從大型真菌的子實體中抽提分離得到ARIs的報道。Sanghyun等26從靈芝Gano