Western blot review

1、Western blot review摘要：本文主要是針對Western bloting的原理及操作進(jìn)行了簡單的闡述，Western印跡法是利用抗原抗體的免疫反應(yīng)，先將蛋白通過SDS-PAGE電泳分離開來，然后再利用電場力的作用將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體（NC膜）上，然后再加抗體形成抗原抗體復(fù)合物，利用發(fā)光或顯色原理將結(jié)果顯示到膜或底片上。同時對Western bloting在實際操作中應(yīng)注意的細(xì)節(jié)問題進(jìn)行了歸納以及與其它免疫技術(shù)就抗體檢測方面進(jìn)行了比較。關(guān)鍵詞：Western bloting；免疫；轉(zhuǎn)膜；顯色；抗體印跡法(bloting)是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢

2、測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC）上，并利用DNA-RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)印跡分析稱為Western印跡法（Western bloting），對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。一、Western bloting的原理    Western bloting首先是要將電泳后分離的蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移到NC膜上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡

3、法。毛細(xì)管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上，在凝膠上放一片NC膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質(zhì)并用重物壓好，緩沖液就會通過毛細(xì)作用流過凝膠。緩沖液通過凝膠時會將蛋白質(zhì)帶到NC膜上，NC膜可以與蛋白質(zhì)通過疏水作用產(chǎn)生不可逆的結(jié)合。但是這種方法轉(zhuǎn)移效率低，通常只能轉(zhuǎn)移凝膠中的一小部分蛋白質(zhì)（10%-20%）。而電泳印跡可以更快速有效的進(jìn)行轉(zhuǎn)移。這種方法是用有孔的塑料和有機(jī)玻璃板將凝膠和NC膜夾成“三明治”形狀，而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進(jìn)行電泳，選擇適當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)在電場力的作用下離開凝膠結(jié)合到NC膜上。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/

4、膜疊層和施加電場的機(jī)械裝置不同。濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。半干轉(zhuǎn)移，用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。與濕轉(zhuǎn)相比，這種方法要快（15-45 分鐘）。轉(zhuǎn)移后的NC膜就稱為一個印跡（blot）,用于對蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測。印跡首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脫脂奶粉溶液）處理以封閉NC膜上剩余的疏水結(jié)合位點，而后用所要研究的蛋白質(zhì)的抗體（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，而其它的蛋白質(zhì)不能與一抗結(jié)合，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)的位置上結(jié)合著一抗

5、。處理過的印跡進(jìn)一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。目前有結(jié)合各種標(biāo)記物的抗體特定IgG的抗體（二抗）可以直接購買，最常用的一種是酶連的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當(dāng)?shù)牡孜锶芤禾幚?，?dāng)酶催化底物生成有顏色的產(chǎn)物時，就會產(chǎn)生可見的區(qū)帶，指示所要研究的蛋白質(zhì)位置。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）。堿性磷酸酶可以將無色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物；而辣根過氧化物酶可以將H2O2

6、為底物，將3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)?-氯萘酚氧化成藍(lán)色產(chǎn)物。另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法，辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾并發(fā)光，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測出辣根過氧化物酶的存在，即目標(biāo)蛋白質(zhì)的存在了。除了酶連二抗作為指示劑，也可以使用其它指示劑，比如：熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記的二抗（可通過紫外燈產(chǎn)生熒光）；生物素結(jié)合的二抗等等。除了使用抗體或蛋白作為檢測特定蛋白的探針以外，有時也使用其它探針如放射性標(biāo)記的DNA，可以檢測印跡中的DNA結(jié)合蛋白。在Western bloting實驗中，有另一種方法，就是直接標(biāo)記一抗，再用底物顯色

7、。這種方法叫直接法，與用二抗的間接法相比有諸多不足，標(biāo)記二抗可用于很多種不同特異性的一抗，避免了標(biāo)記很多一抗的需要，同時因為一抗結(jié)合不止一個二抗分子，所以二抗可以增強(qiáng)信號。所以一般情況下都釆用間接法進(jìn)行檢測。二、Western bloting的操作(間接法)1、蛋白質(zhì)樣品（抗原）的制備：  細(xì)胞的處理方法：向收集到的細(xì)胞中加入RIPA裂解緩沖液（三中蛋白酶抑制在使用前加入，終濃度為2ug/ml）在冰上裂解3060min，然后再插入冰盒進(jìn)行超聲，超聲強(qiáng)度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次2-3秒，重復(fù)3-4次，再離心12000rpm3-5min，吸取上清備用。（超聲強(qiáng)度不能過大，防止

8、蛋白碳化）組織的處理方法：按實驗要求將組織從動物體內(nèi)取出（樣品不宜反復(fù)凍融），取少量（1-2g左右）放入玻璃勻槳器中研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)入EP管中進(jìn)行超聲，超聲強(qiáng)度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次5-7秒，重復(fù)5-6次，再離心12000rpm3-5min，吸取上清備用。上述兩種方法得來的樣品處理液還要加入1/4體積左右的上樣Buffer，然后放在沸水浴中加熱3-4min使蛋白變性，方可作為樣品點樣。（注意：在加熱組織裂解液時，肝臟和腎臟組織要特別注意其本身濃度，最好是在制作裂解液時就適當(dāng)稀釋，否則加熱后會凝結(jié)成固態(tài)。還有些組織處理后很粘稠，有帶絲狀物，這是未裂解的核酸，可以適當(dāng)離心后再用。）2、SDS

9、-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDSPAGE）根據(jù)要求配制好SDS-聚丙烯酸胺凝膠（一般釆用10%的SDSPAGE）將已配制好的凝膠裝入電泳儀中（注意不要漏液）。設(shè)計加樣順序，作好實驗記錄，按預(yù)定順序加樣。一般裂解液我們按10-20ul/道點樣，重組蛋白按1-2ug/道點樣。把電泳裝置與電源連接好，將電壓調(diào)至100V電泳10-20min，待溴酚藍(lán)遷移出積層膠位置再換用200V，30-40min后關(guān)閉電源。從電泳裝置上卸下凝膠玻璃板，用水沖洗干凈，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜。4轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)） 將凝膠玻璃板置于盛有電泳轉(zhuǎn)移緩沖液的容器中，浸泡幾分鐘。 帶上手套，準(zhǔn)備好濾紙和NC膜（83mm×75mm），盡量避免污染

10、濾紙和膜，將裁減好的濾紙和膜浸泡與電泳轉(zhuǎn)移緩沖液中，驅(qū)除留于膜上的氣泡。 打開轉(zhuǎn)移盒并放置淺盤中，用轉(zhuǎn)移緩沖液將海綿墊完全浸透后將其放在轉(zhuǎn)移盒壁上，海綿上再放置一張浸濕的濾紙。 按“海綿濾紙凝膠NC膜濾紙海綿”的順序裝置好（注意不能有氣泡且裝置電極槽不能放反）將冰盒裝入緩沖液槽，注滿4預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液。將整個裝置放在冰浴中用磁力攪拌器攪拌，連接好轉(zhuǎn)移電極恒流300mA轉(zhuǎn)移90min。電轉(zhuǎn)完畢后，將NC膜作好記號置于5%的脫脂奶粉（PBS配制）中封閉，372小時或4過夜。5加一抗與抗原結(jié)合將加樣槽洗滌干凈，將膜用一次性手套覆蓋好，按標(biāo)記和實驗設(shè)計切下膜條并作好記號，按順序置于加樣槽中加入相應(yīng)的一

11、抗約1ml，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。室溫下于搖床孵育2h或4過夜。棄去一抗，膜條仍置于加樣槽，每個槽中的膜用PBST在搖床洗滌洗滌5min左右 ，換液，反復(fù)4-5次。6加二抗與一抗的結(jié)合 根據(jù)實驗需要和設(shè)計選擇合適的酶標(biāo)二抗和稀釋濃度（PBS稀釋），每個加樣槽中加入二抗1ml左右室溫下于搖床孵育1h，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。棄去二抗，膜條仍置于加樣槽，每個槽加PBST在搖床洗滌洗滌5min左右，換液反復(fù)4-5次。7顯色反應(yīng)（重組蛋白一般用AP顯色或是DAB顯色，裂解液一般用發(fā)光法） HRP標(biāo)記二抗用DAB顯色，按順序依次將DAB三種劑各取3滴于5ml蒸餾水中，避光混勻，將膜加入

12、顯色液中避光顯色5-15min終止反應(yīng)，對照Marker記錄實驗結(jié)果，將NC膜晾干掃描保存 AKP標(biāo)記二抗用AP顯色，在10mlAKP緩沖液中加入66µlNBT溶液和33µl BCIP溶液混勻，室溫下將膜放入顯色（37可加速反應(yīng)）5-15min。對照Marker記錄實驗結(jié)果，將NC膜晾干掃描保存。底物發(fā)光法：將兩種顯色底物1：1等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來，馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面（時間根據(jù)光的亮度來衡量），顯影、定影。（熒光在一段時間后會越來越弱要控制好時間）三、Western bloting要注意的一

13、些問題內(nèi)參即是內(nèi)部參照，對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白，它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。其作用是校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。在Western Blotting中使用內(nèi)參其實就是在WB過程中的另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

14、常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要選擇一個在處理因素作用的條件下蛋白含量不會發(fā)生改變的蛋白作內(nèi)參。1、為了讓實驗更加嚴(yán)謹(jǐn)有說服力都要設(shè)計對照實驗，對照分為：陽性對照（最好有標(biāo)準(zhǔn)品（比如-actin，GAPDH）或陽性血清）；陰性對照（測血時用相應(yīng)小鼠未免疫血清（即正常血）；空白對照（不加一抗，用PBS代替）；無關(guān)對照（用無關(guān)抗體）2、一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇最適當(dāng)?shù)谋壤豢苟沟倪x擇直接影響實驗結(jié)果以及背景的深淺。3、實驗設(shè)計時所釆用的抗原批次要一樣，盡量的避免人為的帶來個體差異。特別在做裂解液時更要注意所釆用的操作條件，盡可能的排除可變因素給實驗帶來不確定性。4、凝膠的質(zhì)量直接影響以后的實驗結(jié)果，要特別注意幾點：凝膠要均一沒有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過多，太多會導(dǎo)致膠易脆裂；拔梳子時要快，盡量保證點樣孔平整。5、電泳、轉(zhuǎn)膜時特別要注意正負(fù)極，電壓電