聚合酶鏈式反應和瓊脂糖凝膠電泳 實驗報告

1、實驗三 聚合酶鏈式反應（PCR）以及瓊脂糖凝膠電泳實驗目的1.掌握PCR反應的原理及各反應成分的作用；2.熟悉PCR反應程序的設計規(guī)則；3.掌握引物的設計原則及其與PCR其他成分的配制方法；4.掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理及其應用范圍；5.熟悉瓊脂糖凝膠電泳相關緩沖液的配制方法。實驗原理一聚合酶鏈式反應原理在已知待擴增模板全部或部分序列的情況下，依據(jù)DNA半保留復制的機理，在含有Mg2+的緩沖溶液中，采用耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在特異性引物（分為上游和下游引物）的引導下，通過dNTP為原料，以cDNA或DNA等為模板，在人為控制DNA合成系統(tǒng)（PCR儀）溫度調節(jié)下，通過變性（95）、退火（5

2、0-60 ）及延伸（ 72 ）等3個步驟的循環(huán)進行（30-35循環(huán)），在體外進行雙鏈DNA變性為單鏈，單鏈DNA與特異性引物退火形成局部雙鏈，進而在DNA聚合酶的作用下使引物沿相應模板延伸為特異性引物所限定范圍的大量雙鏈DNA的體外合成反應。本質為體外DNA合成的酶反應。2 瓊脂糖凝膠電泳反應原理 瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。在一定電場強度下偏堿性的緩沖液中（TAE pH8.0或TBE pH7.5-7.8），DNA分子帶負電，其遷移速度取決于分子篩效應，在電荷效應與分子篩效應作用下，具有不同的相對分子量及構型的DNA片段泳動速度不同

3、。DNA 分子的遷移速度與相對分子質量的對數(shù)值成反比關系。 凝膠電泳不僅可分離不同分子量的DNA，也可以分離分子量相同，但構型不同的DNA分子。如質粒的三種構型的泳動速率不同：超螺旋閉合環(huán)狀質粒最快，線型質粒其次，開環(huán)質粒最慢。實驗步驟（一）PCR 加樣術式 在一微量離心管中依次加入下列試劑：水煮裂解后的細菌液 4µL10´PCR buffer（含MgCl2） 2 µLdNTPs (10mM) 1µL5引物(10µM) 1µL 20µL3引物(10µM) 1µLTaq DNA pol. (2U/µ

4、;L) 1 µL去離子水（補足反應體系） 10µL輕彈管底混合（用離心機甩一下）（二）緩沖液組成10×PCR buffer:500 mM KCl100 mM Tris-Cl (pH 8.3)15 mM MgCl2有的會加入硫酸銨(ammonium sulfate)，化學式（NH4)2SO4 ，通過破壞蛋白質在穩(wěn)定因素（親水行），而使蛋白析出。（三）dNTP1. dNTP，（脫氧核糖核苷三磷酸）的縮寫。N是指含氮堿基，代表變量指代A、T、G、C、U等中的一種。是包括dA/G/T/C/TP等在內的統(tǒng)稱，在生物DNA合成中，以及各種PCR中起原料作用。2. 4種dNTP

5、必須等濃度配合以減少錯配誤差，dNTP溶于pH為7.0的NaOH貯存液中，通常的貯存液濃度為10mM，分裝后存放在-20。dNTP使用濃度在0.02-0.2mM之間。3.在PCR反應中，使用低dNTP濃度，可減少非靶位置啟動和延伸時的核苷酸錯誤摻入。4.一般可根據(jù)靶序列的長度和組成來決定最低dNTP濃度。（四）引物設計原則基本原則是最大限度地提高擴增效率和特異性，同時盡可能抑制非特異性擴增。1. 引物長度： 15-30bp，常用20bp左右；2.擴增跨度：以500bp為宜；3.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜；4.避免引物內部出現(xiàn)二級結構和引物間互補；5.引物3端的堿基要求嚴格配對（不能

6、做任何修飾）；6.引物5端可修飾；7.引物的特異性；引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性8.引物量；每條引物的濃度0.1 0.5M，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結果為好；（五）引物配制1. 合成引物一般1OD分裝成1管；2.引物貯存液濃度為10M，需加純水或TE（pH8.0）3. 引物工作終濃度在0.1-0.5M，就可以滿足30個循環(huán)的反應。（六）PCR參數(shù)設置1. 94預變性5分鐘后開始以下循環(huán)2 . 94 30 秒 60 30 秒 30 -35循環(huán) 72 40 秒3. 72 5 分鐘4. 16 保溫實驗過程約1小時30分鐘（七）瓊脂糖凝膠的制備1. 根據(jù)電泳需要，配制合適濃度的電泳及制

7、膠緩沖液。一般為1× TAE或0.5×TBE。注意：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須是相同的。2. 同時配制用于加樣過程的加樣緩沖液，以便于樣本進入膠內。瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的配制方法緩沖液使用液濃貯存液（每升）Tris乙酸（TAE）1×：0.04mol/L Tris乙酸 0.001mol/L EDTA50×：242g Tris堿57.7mL 冰乙酸100mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0)Tris硼酸（TBE）0.5×：0.045moL/L Tris硼酸 0.001moL/L EDTA5×：54g Tris堿 27

8、.5g硼酸 20mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0)含不同量瓊脂糖的凝膠的分離范圍凝膠中的瓊脂糖含量 %（W/V）DNA/RNA分子的分離范圍（ kb ）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-23. 根據(jù)制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準確稱量的瓊脂糖粉，充分搖勻。注意：總液體量不宜超過三角錐瓶的50%容量。4. 在微波爐中加熱溶解瓊脂糖。5. 使溶液冷卻至60左右，如需要可在此時加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5g/mL并充分混勻。（八）瓊脂糖凝膠緩沖液使用方法1.TBE可以使用10次左右，而TAE用23次就要更換。電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA條帶模糊或不規(guī)則DNA帶遷移。2.電泳緩沖液剛好沒過凝膠1mm為好，太多則電流加大，凝膠發(fā)熱。（九）瓊脂糖凝膠載樣緩沖液1.加樣緩沖液是上樣時與樣品混合后一起加入膠空內。加樣緩沖液有三個作用：增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內；使樣品帶有顏色便于上樣操作；其中的染料（溴酚藍和二甲苯氰FF）在電場中以可以預測的泳動速率向陽極遷移。2.溴酚藍在瓊