western blot 指南

1、 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)Western Blot Protocol(中文版基因有限公司 2007年 1月目 錄 . 需要的試劑 . - 1 - . Western檢測方法 . - 2 - . 雙色檢測指南 . - 4 - . 膜的 Stripping . - 4 - . Western檢測優(yōu)化 . - 5 - . 常用提示 . - 6 - . 考馬斯亮藍(lán)染色蛋白凝膠檢測 . - 6 - . 常見問題 . - 7 - . 需要的試劑zNC (硝酸纖維素膜或 PVDF 膜zOdyssey 封阻液(Li-COR, Cat.#927-40000z一抗z近紅外染料標(biāo)記的二抗(Li-COR *zTween

2、 ®-20zPBS 洗脫液z雙蒸水z潤濕 PVDF 膜的甲醇zSDS (如果需要的話z其他的封阻液(如果需要的話* IRDyeTM 800CW染料標(biāo)記的二抗也可以從 Rockland 采購, Alexa Fluor® 680染料標(biāo)記的二抗也可以從 Invitrogen 采購。Odyssey 系統(tǒng)上適用的熒光染料: 有關(guān)適用染料的最新信息請查詢 Li-COR 的網(wǎng)站。 . Western檢測方法NC 膜和 PVDF 膜都可以做蛋白印跡,但是 NC 膜效果更佳。能夠使用純硝酸纖維素更 好。按照標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⒌鞍讖哪z轉(zhuǎn)到膜上,轉(zhuǎn)移模時只能使用鑷子夾住邊緣。轉(zhuǎn)膜后,按照如下步驟操作:

3、1. 將膜在 PBS 中潤濕幾分鐘。 如果使用 PVDF 膜, 先要在 100%甲醇溶液中迅速預(yù)濕,再放入 PBS 之前先浸入雙蒸水里。注意 :z但多數(shù)鋼筆墨水或記號筆在 Odyssey 下有熒光, 墨水被洗掉然后又再到處沉淀在膜上, 產(chǎn)生大斑點和條紋, 使用鉛筆或 Odyssey 專用的記號筆可避免該問題。 PVDF 膜只能使用鉛筆(潤濕在甲醇中,墨水會被洗脫下來2. Odyssey 封阻液封阻膜 1小時, 保證有足夠的封阻液以完全淹沒膜(建議最少 0.4 ml/cm2注意:z必要時,封阻也可以在 4過夜完成z封阻時 切勿 加入 Tween-20, 在未結(jié)束封阻之前膜不能和 Tween-20

4、有任何接觸,否則會造成背景過高z使用 Odyssey 封阻液往往比其他封阻液得到的結(jié)果靈敏度更高。 脫脂奶粉或干酪素溶于 PBS 也可以作為封阻液和抗體的稀釋溶液,但是脫脂奶粉對 PVDF 膜會造成較高的背景, 如果使用 0.1%的干酪素溶液 , 建議溶于 0. 2×PBSz當(dāng)使用抗羊的抗體, 則脫脂奶粉溶液會影響檢測, 而且在 4條件下腐敗的速度也很快,因此被稀釋保存或重復(fù)使用不呼超過幾天zOdyssey 封阻液與 PBS 1:1稀釋不會影響檢測zOdyssey 封阻液可被保存、重復(fù)使用z含有 BSA 的封阻液,但是有些情況下會造成膜的背景過高。因此不推薦使用含 BSA 的封阻液,

5、除非一抗專門要求使用 BSA 作為封阻液3. 用 Odyssey 封阻液稀釋一抗,最佳稀釋比率取決于所用抗體和經(jīng)驗,推薦開始的范圍在 1:1000 1:5000。為了降低背景,在孵育之前稀釋抗體時加入 0.1-0.2%的 Tween 20, Tween-20的最佳濃度也決定于抗體。注意:z雙色檢測要求抗體來源于不同的宿主, 如兔和鼠。 詳細(xì)信息請參考 . 雙色檢測指南4. 室溫下,孵育一抗 60 min或更長時間并緩慢搖動(一抗不同孵育最佳時間也不同 ,使用足夠的抗體溶液以覆蓋整張膜。5. 室溫下用足量的 PBS + 0.1% Tween-20溶液輕柔洗膜 4次,每次 5 min 。6. 用

6、Odyssey 封阻液稀釋紅外染料標(biāo)記的二抗, 避免裝有二抗的試劑瓶長時間見光。推薦稀釋比率為 1:15,000(建議稀釋范圍:1:5,000 1:25,000 。與稀釋一抗一樣,二抗稀釋時也加入 Tween-20。如果需要也可加入 SDS ,但請注意下文提示。注意:z檢測量少的蛋白,則需要的二抗稍多(1:5,000 1:10,000z千萬注意,切勿污染二抗試劑瓶z稀釋的二抗可在 4避光保存并重復(fù)使用。 但是為了得到最佳的靈敏度和效果,最好使用新鮮的二抗稀釋溶液z稀釋二抗時加入 0.01% - 0.02% SDS(也加 Tween-20可以降低背景,特別是使用 PVDF 膜時。但是,切勿在封阻

7、或稀釋一抗時加入 SDS 。請見 .Western 檢測優(yōu)化 ,為什么、怎樣使用 SDS 稀釋二抗。7. 室溫條件下輕搖孵育二抗 30-60 min,此期間避光操作。注意:z孵育超過 60 min可能會增加背景8. 室溫下用足量的 PBS + 0.1% Tween-20溶液輕柔洗膜 4次,每次 5 min 。避光操作。9. 用 PBS 沖洗去除 Tween-20。這時膜已可以準(zhǔn)備掃描。注意:z選擇合適的通道掃描(見 .需要的試劑 z掃描前,膜避光保存z如果準(zhǔn)備做 stripping 或再次使用,要保持膜濕潤,如果膜一旦干燥,則stripping 的效果將會降低z如果需要掃描前膜可以干燥,干膜的

8、信號可能更強。掃描后抹還可以再次被潤濕z避光條件下,膜上的熒光信號可以保持?jǐn)?shù)月或更長。膜可干燥保存也可在 PBS 緩沖液內(nèi) 4保存。z如果膜上的信號過強或過弱,重新掃描的時候相應(yīng)地調(diào)低或調(diào)低掃描亮度分子量 Marker若在凝膠電泳時用的是 Odyssey 預(yù)染分子量 Marker (LI-COR , 則在 700通道可見, 600通道也可以看見淡信號非常微弱。如果 Marker 被數(shù)次反復(fù)凍融,則會降解,則在 800通道 出現(xiàn)數(shù)條高分子量條帶,出現(xiàn)這種情況請換用新的 Marker 。其他來源的藍(lán)色預(yù)染分子量 Marker 也可用于 Odyssey 。僅需使用常用量 1/3,若是用量 過大則分子

9、量條帶過強,則會影響樣品泳道的成像。如果使用彩色 Marker ,一些條帶可能 不會在 Odyssey 上被看到。優(yōu)化提示嚴(yán)格遵循此 protocol每對抗體 -抗原最佳的封阻液是不同的。某些一抗可能在不同的封阻液中降低信號或非 特異條帶。 如果檢測蛋白出現(xiàn)困難, 或許更換封阻液會得到意外的結(jié)果。 如果某種封阻 液用化學(xué)發(fā)光方法可行的話,則在 Odyssey 上繼續(xù)使用它加入像 Tween-20的去垢劑可降低背景和非特異條帶。詳細(xì)內(nèi)容請參考 . Western檢測優(yōu)化為了避免膜上出現(xiàn)斑點, 使用前后雙蒸水浸泡塑料托盤并配制緩沖液, 切勿將膜放入接 觸過考馬斯亮藍(lán)的容器移動膜時只能是用鑷子夾住其

10、邊緣在將膜放入或取出抗體孵育溶液之后, 用雙蒸水或乙醇徹底清洗鑷子, 否則會在墨背景 上造成難以去除的斑點或條紋掃描時, 首先要擦干凈 Odyssey 掃描面板上的灰塵或殘骸等, 這些污物影響成像質(zhì)量或 污染膜, 如果在膜上使用硅樹脂墊子, 則要將與膜接觸的一面弄干凈, 否則灰塵或其他 雜物會落在膜上,切勿使用紙巾擦試墊子,否則會產(chǎn)生更多的斑點掃描時不要使用塑料包裹膜如果準(zhǔn)備做 Stripping ,則千萬不能膜變干燥,膜變干燥或局部出現(xiàn)干燥都會降低 Stripping 的效率 . 雙色檢測指南利用紅外染料標(biāo)記的抗體在不同的信號通路 (700通道和 800通道 , 同一張膜上的兩種 不同抗原可

11、同時被檢測到。雙色檢測需要仔細(xì)選擇一抗和二抗。下述指南有助于雙色檢測試驗的設(shè)計:兩種一抗的種屬來源要不同, 這樣才二抗的特征才能有所區(qū)別 (例如來源于兔和鼠的一 抗分別需要抗兔和抗鼠的二抗來匹配在組合雙色試驗的一抗之前, 往往需要對每個一抗單獨在膜上檢測, 看是否出現(xiàn)預(yù)期的 條帶和可能低背景條帶。 輕微的交叉反應(yīng)會在兩種抗體間發(fā)生, 這就使檢測的問題更復(fù) 雜, 特別是抗原量比較大的情況下。 如果出現(xiàn)交叉反應(yīng), 則減小蛋白的上樣量或減小抗 體的用量一個抗體標(biāo)記 700通道的染料,則另一個抗體只能標(biāo)記 800通道的雙色檢測優(yōu)先選用高交聯(lián)吸附力的二抗,否則會出現(xiàn)交叉反應(yīng)為了不影響雙色檢測,避免兩種分

12、別來源于親緣關(guān)系太近的小鼠和大鼠的一抗同時使 用,如果不得不這么使用的話,必須先做每種抗體的單色檢測,確定出現(xiàn)預(yù)期的帶形 如果可能,二抗應(yīng)該選擇來源于同一宿主(例如,羊抗鼠和羊抗兔以減小二抗之間的 反應(yīng)。因為二抗不會識別來源于其他種屬的免疫球蛋白。如果進(jìn)行雙色檢測,則遵循標(biāo)準(zhǔn)的 Western protocol并有以下區(qū)別:z第 3步,在抗體稀釋緩沖液中混合兩種一抗,同時與膜孵育(第 4步 。一抗 必須 來源 于不同宿主z第 6步,在抗體稀釋緩沖液中混合染料標(biāo)記的兩種二抗,同時與膜孵育(第 7步 . 膜的 StrippingPVDF 膜可以 Stripping ,一般不使用 NC 膜。如果準(zhǔn)備

13、 Striping ,則膜成像前后以及成像過程中都不能干(盡可能保證膜的濕潤狀態(tài) 。其他檢測方法中常用的 Stripping 技術(shù)在 Odyssey 上也可以使用。Stripping 緩沖液:25 mM pH2.0的甘氨酸 + 1-2% SDSStripping 程序:1. 室溫下在 Stripping 緩沖液中搖動孵育 10-15 min2. 換掉 Stripping 緩沖液,再搖動孵育 10-15 min3. 在 PBS + 0.1% Tween-20溶液中搖動沖洗 5 min4. PBS 溶液浸泡后, 在 337 µm的分辨率下快速掃描看信號是否完全去除,如果仍信號殘留則重復(fù)上

14、述步驟,特別是強帶或抗體。經(jīng)常更換Stripping 緩沖液會有作用的。5. 當(dāng)做下次檢測時,重新封阻 30-60 min,并作后續(xù)的抗體孵育提示:如果膜被過度剝離,會造成目標(biāo)蛋白丟失,掃描膜看 stripping 是否完全,如果出現(xiàn)過 度剝離,則減小 Stripping 緩沖液中的 SDS 用量根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的強度,決定 stripping 的強度,如果很強,則可以通過把 SDS 濃度 從 1%提高至 1.5-2%,或者預(yù)熱 stripping 緩沖液至 65,把熱緩沖液倒入在室溫下?lián)u 動,也可使用恒溫?fù)u床。如果溫度提高,則需要經(jīng)常掃描,檢查是否過度剝離 . Western檢測優(yōu)化當(dāng)從原有

15、的 Western 方案向 Odyssey 轉(zhuǎn)換時,或使用一個新的一抗時,一抗?jié)舛鹊膬?yōu)化 尤為重要,以達(dá)到的靈敏度和穩(wěn)定性。3個因素需要優(yōu)化:一抗?jié)舛?、染料?biāo)記的二抗?jié)舛?、抗體稀釋液內(nèi)的去垢劑濃度。一抗?jié)舛纫豢乖谫|(zhì)量、親和力和濃度上存在較大的差異。正常工作濃度范圍取決于所用一抗的特 性和目標(biāo)抗原的量。建議稀釋比率為 1:500、1:1500和 1:10,000(開始可參照以前化學(xué)發(fā) 光法的濃度 。優(yōu)化一抗的濃度將其效果發(fā)揮到最大并妥善保存。二抗?jié)舛冉ㄗh稀釋比率為 1:5000、1:10,000和 1:20,000。二抗的用量與被待檢測抗原的多少密 切相關(guān)如果被檢測蛋白量越大,則需要的抗體量就越

16、小去垢劑濃度稀釋抗體時加入去垢劑可有效降低膜上的背景。由于使用的抗體、膜和封阻液的種類不 同,去垢劑的濃度也不同。有些一抗與抗原結(jié)合的不是很牢,過多的去垢劑會降之洗掉。在 封阻未結(jié)束之前,不要讓去垢劑與膜接觸,否則背景會很高。Tween-20z在未結(jié)束封阻之前,不能出現(xiàn) Tween-20z用封阻液稀釋一抗和二抗時均加入 Tween-20。建議, NC 膜最終濃度為 0.1-0.2%, PVDF 膜為 0.1%(濃度太高則背景也高z洗脫液內(nèi)含 0.1%Tween-20SDS :z二抗稀釋液中加入 0.01 - 0.02%的 SDS 可顯著降低整章膜的背景,并減少或消除非 特異條帶。但很重的一點就

17、是用量要少,作為一種離子去垢劑 SDS 的用量在檢測任 何步驟使用過量,都會破壞抗原 -抗體反應(yīng)。z對 PVDF 膜降低背景更有效z封阻或稀釋一抗時切勿加入 SDS 。 一抗孵育時如果存在 SDS 則會大大降低信號強度。 只能在稀釋二抗時加入 SDS 。z封阻液稀釋二抗時,可 同時 加入 0.1 0.2%的 Tween 和 0.01 0.02%的 SDS 。 z洗脫液只能包含 0.1% Tween-20,但決不能有 SDSz某些抗體 -抗原反應(yīng)對 SDS 非常敏感,允許的濃度非常低(小于 0.01% ?？捎玫味?法測定最佳濃度。 . 常用提示封阻未結(jié)束之前切勿將膜與 Tween-20接觸,否則

18、膜背景會過高牛奶封阻液可能會含有 IgG 而與羊抗的抗體反應(yīng),會顯著增加背景和降低信號為延長封阻液使用時間或降低使用量:重復(fù)使用封阻液稀釋抗體;與 PBS 1:1稀釋;過 量使用的封阻液護守保存在 4數(shù)天(不要倒回原是試劑瓶,分開保存抗體 4避光保存,切勿反復(fù)凍融,否則抗體性能會降低。減小見光時間,避免試劑抗 體試劑瓶,使用前快速稀釋。若抗體溶液出現(xiàn)微粒,則需要先離心再使用。二抗孵育和洗脫時,盡可能避光操作做膠時選用齒最窄的梳子,以利用上樣后濃縮目標(biāo)蛋白試驗中抗體抗原不同, 則最佳的轉(zhuǎn)膜條件、 膜和封阻試劑也有所不同。 如果出現(xiàn)背景高, 信號弱時,最先要解決的就是換另一種封阻液為了達(dá)到最佳的靈

19、敏度,請使用 NC 膜微量的純化蛋白可能不能有效轉(zhuǎn)膜, 可以加一些相同分子量的非特異蛋白, 產(chǎn)生 “攜帶” 效果,提高轉(zhuǎn)膜效率對于 <100kDa的蛋白, 無 SDS 的 Tri-甘氨酸緩沖液溶液中轉(zhuǎn)膜 (含 20%的甲醇 。 SDS 無論對于 PVDF 還是 NC 膜都會降低蛋白和膜的結(jié)合效率轉(zhuǎn)膜前先把膠浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中 10 - 20min,可以起到平衡凝膠并去除 SDS 的作用。 不會將 SDS 帶入轉(zhuǎn)膜槽中要最大化蛋白和膜的結(jié)合力,轉(zhuǎn)膜后可完全風(fēng)干膜(約 1-2h 切勿過封阻。長時間封阻,尤其是用 2%或濃度更高的脫脂牛奶,會造成膜上目標(biāo)蛋的 損失(J. Immunol. Me

20、th. 122:129-135, 1989為了增強信號,可嘗試延長室溫下一抗的孵育時間或 4過夜 . 考馬斯亮藍(lán)染色蛋白凝膠檢測Odyssey 可以掃描考馬斯亮藍(lán)(甲醇溶和水溶染色的凝膠,可在 700通道成像, 800通 道有微弱信號。 Odyssey 較常規(guī)檢測靈敏度高,水溶的染色液靈敏度最高;水中對凝膠過夜 退色效果更好。凝膠檢測步驟:1. 在褪色液或水中完全浸泡凝膠去除染料顆粒,這些顆粒會造成像結(jié)果上出現(xiàn)斑點2. 將凝膠放在掃描面板上,不要產(chǎn)生氣泡?？捡R斯亮藍(lán)染色凝膠部建議使用硅樹脂墊子,因為完全去掉墊子上的污物有些困難3. 通道掃描凝膠。焦距是凝膠厚度的 1/2(即 1mm 厚的凝膠,

21、焦距設(shè)置為 0.5mm 4. 掃描結(jié)束后拿掉凝膠, 仔細(xì)清潔玻璃掃描面板,除去殘留污漬5. 如果仍出現(xiàn)條紋,用戴手套的手指無屑紙巾揩凝膠。制干膠也可以解決條紋問題或在干膠溶液中洗膠不超過 5min 防止靈敏度降低。還可以使用 Odyssey 軟件中的 filter/noise消除功能以減小條紋(見 Odyssey 使用指南 . 常見問題問題 可能原因 解決辦法封阻液中使用了 Tween-20 封阻之前膜不能和 Tween-20接觸封阻液中使用了 BSA 封阻液中含有 BSA 可導(dǎo)致高 背景, 加入 SDS 以降低背景或 更換封阻液未使用優(yōu)化的封阻試劑 比較不同的封阻液選擇最佳 的使用;延長封阻

22、時間 NC 膜的背景 抗體稀釋液中加入 Tween-20降低背景。 加入 SDS 稀釋二抗 PVDF 膜的背景 抗體稀釋液中 Tween-20的濃 度降低至 0.1%。加入0.01-0.02%的 SDS 稀釋二抗 抗體濃度過高 優(yōu)化一抗和二抗的濃度 增加洗脫次數(shù)和緩沖液體積 洗脫不足確定緩沖液內(nèi)含 0.1%的 Tween-20,必要時也可增加。 過量的 Tween-20(0.5-1% 也 會降低信號緩沖液內(nèi)的雜物和抗體交叉 反應(yīng) 將牛奶換成 Odyssey 封阻液。 牛奶中可能存在的 IgG 會與 羊抗的二抗交叉反應(yīng)高背景、不規(guī)則分布抗體體積不足 使用足夠體積的抗體使膜一時也可使用熱密封袋 。

23、切勿 使膜任何位置干燥抗體體積不足(接上頁 在搖床上孵育高背景、不規(guī)則分布(接上 頁膜污染小心使用鑷子移動膜。 膜不能 干燥。 使用干凈的盒子、 袋子 或托盤小體積體系內(nèi)同時封阻多張 膜多張膜同時封阻時, 使用足夠 體積的緩沖液, 膜可自由移動 并完全被液體淹沒膜一直處于潤濕狀態(tài), 如果膜 要重復(fù)使用或作剝離則這一 點很重要膜未完全潤濕或出現(xiàn)局部干 燥若使用 PVDF 膜,則需要先用 100%的甲醇潤濕在鑷子從抗體溶液拿出后仔 細(xì)清洗, 特別是染料標(biāo)記的二 抗溶液。 臟鑷子會在膜上留下 不能洗掉的染料沉淀 鑷子或盤子已被污染孵育時, 使用潔凈的盤子、 袋 子或托盤掃描面板或硅樹脂墊子不干 凈每

24、次使用時仔細(xì)清潔面版和 墊子。 灰塵、 碎屑或殘留物都 會在膜上造成條紋不合適記號筆或鋼筆在膜上 做記號只能使用鉛筆或 Odyssey 專用 記號筆在膜上標(biāo)記未使用最好的封阻試劑 使用不同封阻劑, 一抗的表現(xiàn) 也不同一抗結(jié)合力可能過低, 增加抗 體的量環(huán)更換其他來源的抗 體延長一抗孵育時間(室溫 4-8小時,或4過夜 增加一抗或二抗的用量并優(yōu) 化更換為其他可替代的二抗 抗體量不足一抗或二抗可能過保質(zhì)期或 保存不當(dāng)而失效去垢劑使用過量; 信號被洗脫 掉減少抗體稀釋液中的Tween-20和 /或 SDS 的含量。 推薦 SDS 濃度為 0.01 0.02%,某些抗體可能要求更 低的濃度背景出現(xiàn)不規(guī)

25、則的氣泡或條 紋蛋白上樣量過低提高上樣量, 制膠時使用齒最檢查轉(zhuǎn)膜緩沖液和轉(zhuǎn)膜步驟 蛋白轉(zhuǎn)膜質(zhì)量不高 蛋白轉(zhuǎn)膜質(zhì)量不高(接上頁 使用預(yù)染分子量 Marker 監(jiān)控轉(zhuǎn)膜。 轉(zhuǎn)膜后對凝膠染色, 確 保凝膠不能被著色 檢測過程中蛋白損失封阻時間太長或抗體稀釋液 中去垢劑含量過高都會造成 膜上抗原的損失轉(zhuǎn)膜后膜完全風(fēng)干(1-2h , 將有助于不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)合 加入 20%的甲醇也利于蛋白 與膜的結(jié)合。注意:甲醇會縮小凝膠的孔 徑, 因而可能會阻止大分量蛋 白的轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜緩沖液內(nèi)的 SDS 可能會 對膜上的蛋白造成干擾, 特別 是小分量的蛋白, 因而減小或 不用 SDS 。 注意:對某些蛋白 SDS 能提高

26、 轉(zhuǎn)膜效率背景出現(xiàn)不規(guī)則的氣泡或條 紋(接上頁轉(zhuǎn)膜過程中蛋白不能保留在 膜上小分量蛋白直接穿過膜, 則換 用孔徑較小的膜, 或縮短轉(zhuǎn)膜 時間降低抗體用量 縮短抗體孵育時間 抗體稀釋液中提高 Tween-20的用量抗體濃度太高 二抗稀釋液中增加或提高 SDS 用量未使用優(yōu)化的封阻液 更換封阻液核對一抗和二抗的來源和宿 主種屬(見 . 雙色檢測指 南只使用高吸附的二抗 雙色檢測存在交叉反應(yīng)的可 能, 可減小二抗的用量降低發(fā) 生交叉反應(yīng)的幾率非特異或非目標(biāo)條帶雙色檢測中的交叉反應(yīng)盡可能避免同時使用抗小鼠 和抗大鼠的抗體, 由于種屬親 緣關(guān)系太近, 一定程度上抗小 鼠的抗體與大鼠的 IgG 會發(fā) 生反

27、應(yīng), 同樣的反應(yīng)也存在于 抗綿羊和抗山羊的抗體之間Odyssey Western Protocol 檢查所用的染料。像 Alexa Fluor 750熒光染料在兩個通 道之間都可發(fā)光, 不推薦使用 如果信號在一個通道很強 (接 近或達(dá)到飽和 ,則可能會在 另一個通道有少量泄露, 調(diào)低 掃描亮度可解決此問題 非特異或非目標(biāo)條帶(接上 頁 信號在兩個通道之間的泄露以后的實驗可以降低蛋白上 樣量或抗體用量 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)In-Gel Western Protocol(中文版基因有限公司 2007年 1月目 錄 . 所需試劑 . - 1 - . 描述 . - 1 - . 雙色 In-Gel W

28、estern蛋白檢測指南 . - 1 - . 電泳 . - 2 - . In-Gel Western檢測 Protocol . - 2 - . 優(yōu)化 . - 3 - . Stripping和 Reprobing . - 3 - . 常見問題 . - 4 - . 所需試劑Odyssey 試劑z近紅外染料標(biāo)記的二抗(LI-COR *其他試劑z電泳所用的 SDS 凝膠z50%異丙醇 + 5%乙酸(超純水配制z封阻液(5%BSAz一抗zTween-20zPBS 緩沖液z超純水* IRDyeTM 800CW染料標(biāo)記的二抗也可以從 Rockland 采購, Alexa Fluor® 680染料標(biāo)

29、記的二抗也可以從 Invitrogen 采購。 . 描述Western 蛋白檢測需要電泳分離蛋白混合樣品,然后再將分離后的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)到 NC 膜或 PVDF 膜上。 Odyssey 可以不需要轉(zhuǎn)膜而直接在凝膠中檢測蛋白,這個技術(shù)可大大節(jié)省 時間和費用,而且還能消除轉(zhuǎn)膜、封阻過程中可變因素的影響。 In-Gel Western檢測僅需常 規(guī)的 Odyssey 試劑而無須特殊的試劑盒。電泳之后,凝膠在異丙醇乙酸溶液里簡單固定之后,沖洗,然后和傳統(tǒng)的 Western 檢測 一樣,在凝膠上孵育、洗脫。濕膠直接在 Odyssey 上掃描。該過程無需底物、塑料包裹和曝 光底片。用 Odyssey 在凝膠

30、上還可以實現(xiàn)兩個蛋白的雙色檢測。In-Gel 檢測可以快速得到實驗結(jié)果,也能讓結(jié)果更準(zhǔn)確,因為避免轉(zhuǎn)膜過程中蛋白的損 失等問題。 如果目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)膜效果不好 (比如, 轉(zhuǎn)膜過程中, 大分子量蛋白很難從膜中轉(zhuǎn)出, 或小分子量蛋白穿過膜 , In-Gel 檢測避免這類問題。然而重要的是請注意 In-Gel 檢測可能 不能作定量。 . 雙色 In-Gel Western蛋白檢測指南雙色檢測的抗體謹(jǐn)慎選擇是非常重要的,否則會出現(xiàn)交叉反應(yīng)。關(guān)于一抗和二抗的選擇 請參考以下指南:a. 兩個二抗要求必須是高吸附性的, 以消除交叉反應(yīng)b. 兩個一抗必須是來源于不同種屬的宿主, 這樣才可以被不同特性的二抗區(qū)分并識

31、別 (如,一抗來源于兔和小鼠的,可分別被抗兔和抗小鼠的二抗識別c. 兩個二抗必須來源于同一種屬的宿主 ,以避免二抗之間的交叉反應(yīng)。樣品中可能存 在的其他種屬免疫球蛋白是不會被二抗識別的d. 一個二抗標(biāo)記 IRDye 800的染料, 則另一個就要標(biāo)記 IRDye 680(或 Alexa Fluor 680、 Cy 5.5等e. 雙色檢測之前,先對每個抗體單獨作轉(zhuǎn)膜檢測看是否達(dá)到預(yù)期效果?？赡軙霈F(xiàn)輕 微的交叉反應(yīng),特別是抗體用量過大時,是檢測的問題更復(fù)雜。如果確實存在交叉 反應(yīng),將降低蛋白的上樣量或抗體的用量。f. 為了取得最佳的結(jié)果,雙色檢測盡量避免同時使用來源于小鼠和大鼠的一抗。因為 親緣關(guān)

32、系太近,不可能完全避免交叉反應(yīng)。如果確實要同時使用這兩種一抗,則需 要先祖但通道檢測的預(yù)實驗雙色檢測實驗方案的調(diào)整對于雙色外檢測,請遵照下文的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟并作如下的調(diào)整:1. 使用兩種染料標(biāo)記的二抗2. 確定抗體特性和宿主來源的合適性,以免出現(xiàn)交叉反應(yīng)3. 在第 5步,用抗體稀釋液混合兩種一抗,同時與凝膠孵育4. 在第 8步,用抗體稀釋液混合兩種二抗,同時與凝膠孵育 . 電泳1. 電泳分離目標(biāo)蛋白注意:z凝膠類型會影響 In-Gel Western檢測的成功和靈敏度。 因此需要對凝膠作 優(yōu)化z凝膠厚度和丙烯酰胺的濃度會影響抗體分子進(jìn)入凝膠。通常建議凝膠濃 度不高于 12%,厚度在 1-1.5m

33、mz不同預(yù)制膠的表現(xiàn)也有一定的差異。推薦 NOVEX Tris-glycine預(yù)制膠, 當(dāng)然,其他的預(yù)制膠也可以使用 . In-Gel Western檢測 Protocol2. 電泳之后分開兩塊玻璃板,濃縮膠(堆積膠可能會造成掃描時高背景。如果 出現(xiàn)疊加,可用手術(shù)刀切除濃縮膠,并且切一個角作為記號3. 異丙醇 + 5%乙酸(超純水配制中孵育凝膠 15min ,溶液足量保證凝膠被 完全淹沒病可自由移動,緩慢搖動In-Gel Western Protocol 重要:凝膠輕拿輕放,積壓會在掃描圖像上出現(xiàn)斑點或指紋 4. 去掉異丙醇 /乙酸, 超純水洗 15分鐘并緩慢搖動。 足量水保證凝膠完全淹沒且可

34、自由移動。凝膠可能會卷曲并 /或浮在液面,輕輕鋪平凝膠或反轉(zhuǎn),保證液體完 全覆蓋凝膠。凝膠表面殘留的酒精會造成條帶擴散提示:如果需要,可在這步暫停,在水中 4保存過夜 5. 只要還沒有開始準(zhǔn)備孵育抗體就不要做封阻。在含有 0.1%Tween的 Odyssey 封阻液、 PBS 或 5%BSA(BSA 效果最好 中按照需要的濃度稀釋一抗。 由于 In-Gel Western 檢測的靈敏度不及標(biāo)準(zhǔn)的 Western 檢測,一抗的用量應(yīng)較平時的量多一 些。確定凝膠被抗體稀釋溶液完全淹沒。緩慢搖動孵育一抗 1h 6. 一抗孵育可延長至 7h ,或 4過夜7. 在足量的 PBS + 0.1%Tween-

35、20緩慢搖動分 3次洗膠 10min8. 在含有 0.1%Tween-20合適的封阻液中按 1:1000 1:5000的比例稀釋抗體, 緩慢搖動凝膠上孵育二抗 1h ,避光操作。足夠的溶液已完全覆蓋凝膠 9. 在足量的 PBS + 0.1%Tween-20緩慢搖動分 3次洗膠 10min 10. 中洗膠 5min11. 濕膠直接放在 Odyssey 系統(tǒng)掃描面板上,可直接掃描或塑料包裹防止凝膠干燥。焦距設(shè)置為凝膠厚度的 1/2。如果濃縮較未切除,可在掃描成像圖片后,用 Odyssey 軟件裁剪 12. 如果掃描背景過高,可將凝膠浸泡在 PBS 過夜之后再掃描。 4避光保存。在 4凝膠可被保存數(shù)

36、日 . 優(yōu)化對于您的目標(biāo)蛋白或凝膠, In-Gel Western protocol可能需要優(yōu)化。 然而, 無論怎樣, In-Gel Western 檢測的靈敏度都不及標(biāo)準(zhǔn)的 Western 檢測。轉(zhuǎn)膜對蛋白有濃縮作用,而在凝膠里, 蛋白石分布在整個凝膠厚度上的。對于優(yōu)化有如下原則:優(yōu)化抗體稀釋液及其 Tween-20的濃度,可優(yōu)化信噪比 使用不同的抗體稀釋緩沖液, 包括單獨的 PBS 、 Odyssey 封阻液、 脫脂牛奶、 BSA 、 PierceSuperBlock 等。不同的封阻液的效果也有很大不同。 BSA 效果最佳(通常轉(zhuǎn)膜 Western 檢測不推薦使用 BSA ,然而在 In-

37、Gel Western中 BSA 效果非常好 . Stripping和 ReprobingIn-Gel Western檢 測 也 可 作 Stripping 和 Reprobing 。 Stripping 緩 沖 液 推 薦 25mM Glycine-HCl pH 2.0 + 2%SDS。足量剝離液中室溫條件下,剝離凝膠 30-60min ,每 15-30min 換一次剝離緩沖液。之后在 PBS + 0.1%Tween-20中全面洗膠。為了監(jiān)控剝離效果,高分辨 率(337µm快速掃描凝膠。完成剝離的時間取決于原始信號的亮度,以及一抗和抗原結(jié)合 的強度。 . 常見問題問題 可能的原因解

38、決辦法濃縮膠存在 電泳后切掉濃縮膠 抗體用量過大降低二抗的濃度由于孵育的緩沖液用量不足造成 的背景不均勻每個步驟 (固定、 洗脫和抗體孵育 都是用足夠的緩沖液且凝膠可自 由移動擠壓可造成背景上出現(xiàn)斑點 輕拿輕放凝膠、 并每次只能接觸凝 膠邊緣使用足量的緩沖液凝膠可自由移 動。防止凝膠粘在容器底部 凝膠背景高凝膠未徹底洗脫延長洗脫時間或增加洗脫次數(shù), 室 溫下凝膠避光浸泡在 PBS 中過夜 也能降低背景增加一抗和 /或二抗的量。 4過夜 孵育一抗抗體用量不足In-Gel Western檢測沒有轉(zhuǎn)膜檢測 那么靈敏, 需要相應(yīng)增加樣品上樣 量和抗體濃度嘗試不同的稀釋液, 對于某些一抗 的效果是有影響

39、的稀釋一抗的緩沖液不理想建議緩沖液含 3-5%BSA, Odyssey 封 阻 液 和 PBS 或 TBS (都 含 0.1%Tween-20 。其他封阻液(脫 脂牛奶、 干酪素、 其他商業(yè)化封阻 液和 Tween-20的濃度也可嘗試凝膠類型不理想 檢測推薦 NOVEX 的預(yù)制膠。 其他來源的或自制的凝膠也可 使用, 但可能靈敏度降低或需要更 多的優(yōu)化 丙烯酰胺含量太高, 可降低膠濃度 增加抗體溶液體積, 保證凝膠完全 浸沒在抗體中抗體未完全或不均勻進(jìn)入凝膠確定凝膠已被充分固定。 某些單克 隆抗體對凝膠內(nèi)殘留的酸很敏感, 遇到這樣的問題, 可在固定液中去 除乙酸或延長水洗時間無信號或信號 弱凝

40、膠在異丙醇 /乙酸溶液中時間過 長蛋白會從凝膠中損失。固定只能 15min條帶模糊或不 規(guī)則凝膠類型不合適 檢測推薦 NOVEX 的預(yù)制膠。 其他來源的或自制的凝膠也可 使用, 但可能靈敏度降低或需要更多的優(yōu)化上樣量過大嘗試降低蛋白上樣量; 如果條帶內(nèi) 的蛋白上樣量太高則條帶會出現(xiàn) “滿是斑點”凝膠固定不充分如果按照上述方案問題依然存在, 可嘗試調(diào)節(jié)異丙醇或乙酸 抗體濃度太高減少抗體用量或縮短抗體孵育時 間雙色檢測中抗體交叉反應(yīng) 躋身選用抗體,見 . 雙色 In-Gel Western 蛋白檢測指南嘗試不同的稀釋液, 對于某些一抗 的效果是有影響的一抗稀釋緩沖液不理想建議緩沖液含 3-5%BS

41、A, Odyssey 封 阻 液 和 PBS 或 TBS (都 含 0.1%Tween-20 。其他封阻液(脫 脂牛奶、 干酪素、 其他商業(yè)化封阻 液和 Tween-20的濃度也可嘗試非特異或非目 標(biāo)條帶兩個通道之間的信號泄露如果信號在一個通道很強 (接近或 達(dá)到飽和 ,則可能會在另一個通 道有少量泄露, 調(diào)低掃描亮度或減 少抗體的用量可解決此問題 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)In-Cell Western ProtocolEGF 對 A431細(xì)胞刺激效應(yīng)的評估(中文版基因有限公司 2007年 1月目 錄 . 需要的試劑 . - 1 - . 養(yǎng)細(xì)胞、刺激和檢測 A431細(xì)胞對 EGF 的反應(yīng) . -

42、 1 - . 實驗注意事項 . - 4 - . 實驗結(jié)果 . - 5 - . 需要的試劑Odyssey 試劑zIRDye 800CW標(biāo)記的山羊抗小鼠的二抗(LI-COR Cat.# 926-32210 *zIRDye 680標(biāo)記的山羊抗兔二抗(LI-COR Cat.# 926-32221 * LI-COR和 Rockland 也有其他類型 IRDye 800CW標(biāo)記的二抗; Invitrogen 也有其他類型 Alexa Fluor 680二抗zOdyssey 封阻液(LI-COR Cat.# 927-40000其他試劑z1×PBS洗脫液z細(xì)胞培養(yǎng)試劑(血清,DMEM,胰島素,1&#

43、215;PBSz20% Tween-20zEGF(表皮生長因子 (Upstate Cat.# 01-107z37%甲醛z10% Triton X-100zNunc 96孔板(Nunc Cat.# 167008z下述的一抗特別注意:磷酸化 EGFR 和磷酸化 ERK 分別從 CST 和 Santa Cruz購買。血清饑餓細(xì)胞要達(dá) 到最大的反應(yīng)。 . 養(yǎng)細(xì)胞、刺激和檢測 A431細(xì)胞對 EGF 的反應(yīng)1. 按照標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)步驟,在 DMEM 和 10%小牛血清(FCS ; Gibco 的長頸瓶 中培養(yǎng) A431細(xì)胞,直到達(dá)到 80-90%的細(xì)胞覆蓋度(confluency (約 1.5×

44、;107個 細(xì)胞2. 去除培養(yǎng)基、滅菌的 1×PBS洗細(xì)胞,然后再用胰島素酶化細(xì)胞3. 離心法轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞小球4. 輕輕敲打管壁, 去除上清和懸浮的細(xì)胞球。 避免用移液器大力吸打或用 V oetex 震 蕩,以保證細(xì)胞的完整性5. 用全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至 20ml ,并用血球計計數(shù)6. 用全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至 200,000細(xì)胞 /ml7. 輕輕的充分混合細(xì)胞懸浮頁8. 滅菌條件下,向 96孔板每孔分裝 200µl細(xì)胞懸浮液(40,000細(xì)胞 /孔9. 孵育細(xì)胞并監(jiān)測細(xì)胞密度,直到每個孔內(nèi)細(xì)胞都匯合,這個過程大約需要 3天 10. 加熱不含血清的培養(yǎng)基(D-MEM ;

45、Gibco 到 3711. 用真空器抽氣去除微孔板內(nèi)的全培養(yǎng)基12. 向每個孔內(nèi)更換 200µl不含血清、預(yù)熱的培養(yǎng)基,孵育 4-6h13. 在另一個 96孔板的每個孔內(nèi)分裝 100µl D-MEM14. 第一和第二個孔不加 EGF (休眠細(xì)胞對照 。其余的孔內(nèi)加入 EGF ,濃度按倍比 梯度從 0.2-100ng/ml。實驗設(shè)計見圖 1。15. 抽氣法去除每個孔內(nèi)的饑餓培養(yǎng)基16. 將分裝微孔板內(nèi)的 EGF 稀釋溶液轉(zhuǎn)移到含有細(xì)胞的微孔板內(nèi)17. 孵育 7.5min18. 準(zhǔn)備新鮮的 固定緩沖液 :1×PBS 45.0 ml37%甲醛 5.0 ml3.7%甲醛

46、50.0 ml19. 抽氣法去除含有 EGF 的培養(yǎng)基, 迅速加入 150µl的新鮮 固定緩沖液 固定細(xì)胞, 免 搖動在室溫條件下孵育 20min 。 加固定緩沖液時,小心地用移液器沿管壁加入, 避免使細(xì)胞分離20. 準(zhǔn)備 Triton 洗脫緩沖液 :1×PBS 495 ml10% Triton X-100 5 ml1×PBS + 10% Triton X-100500 ml21. 抽氣法去除 固定緩沖液22. 用 Triton 洗脫緩沖液 分 4次洗脫細(xì)胞,每次 200µl 5min,以保證可以滲透細(xì)胞 注意:z每次洗脫可在搖床上進(jìn)行,室溫條件下 5m

47、inz洗脫過程中,切勿讓孔 /細(xì)胞變干,每次操作之后快速加入洗脫液23. 抽氣法去除 Triton 洗脫緩沖液24. 每個孔內(nèi), 小心地從管壁加入 150µl LI-COR Odyssey封阻液 (#927-40000 , 在搖 床上緩慢搖動室溫下孵育 1.5h 。注意:z一種封阻液不是對每對抗原 -抗體的效果都理想的,某些一抗在不同的封 阻液中可能會出現(xiàn)信號大幅度降低或表現(xiàn)非特異性條帶。如果目標(biāo)蛋白 不能被檢測,嘗試更換一種封阻液可能會大大改善實驗結(jié)果。如果以前 化學(xué)發(fā)光所用的封阻液和一抗效果不錯,那么在 In-Cell Western中繼續(xù) 使用這個抗體和封阻液zOdyssey

48、封阻液于其他封阻液相比,具有更高的靈敏度和高穩(wěn)定的表現(xiàn)。 脫脂奶粉或干酪素溶于 PBS 也可用于封阻和稀釋抗體。如果使用抗羊的 的抗體,則脫脂奶粉封阻液會有干擾,而且即使 4條件下很容易腐敗, 所以難以長期保存,且只能在數(shù)天之內(nèi)重復(fù)使用。如果使用干酪素,推 薦在 0.2×PBS緩沖液里濃度為 0.1%z也可使用含有 BSA 的封阻液,但某些情況下會造成背景過高,所以通常 不推薦使用這類封阻液,除非一抗特別要求封阻液含有 BSA In-Cell Western Protocol25. 在 LI-COR Odyssey封阻液中稀釋抗體要注意如下提示:一抗可以按照不同組合加入,通常一種抗體

49、可以抗磷酸化目標(biāo)蛋白,另一種抗體 是抗目標(biāo)蛋白(無論磷酸化狀態(tài)如何 。下列建議的一抗組合取決于被檢測的目 標(biāo)蛋白:a. Phospho-EGFR Tyr1045(兔, 1:100稀釋, CST 2237Total EGFR(小鼠, 1:500稀釋, Biosource International AHR5062 b. Phospho-EGFR Tyr1045(兔, 1:100稀釋, CST 2237Total ERK2(小鼠 ; 1:75稀釋, Santa Cruz Biotechnology SC-1647 c. Phospho-ERK (小鼠, 1:100稀釋, Santa Cruz Bi

50、otechnology SC-7383 Total ERK1(兔, 1:200稀釋, Santa Cruz Biotechnology SC-94d. Phospho-EGFR Tyr1045(兔, 1:100稀釋, Cell Signaling Technology 2237 Phospho-ERK (小鼠, 1:100稀釋, Santa Cruz Biotechnology SC-7383 26. 在一批微孔內(nèi)分別加入 50µl的 LI-COR Odyssey封阻液,作為由于近紅外染料標(biāo) 記的二抗可能產(chǎn)生背景的對照。實驗設(shè)計見圖 1的例子27. 在加入微孔前充分混合兩種一抗溶液28. 抽吸其他微孔內(nèi)的封阻液并加入 50µl已混合好的一抗,一抗溶液應(yīng)該覆蓋管底 29. 室溫條件下緩慢搖動,孵育一抗 2h注意:a. 為達(dá)到最高的靈敏度,4不搖動孵育過夜b. 為防止細(xì)胞干燥,過夜孵育時需蓋住微孔板30. 準(zhǔn)備 Tween 洗脫液 :1×PBS 995 ml20% Tween-20 5 ml1×PBS + 0.1% Tween-201000 ml