醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗指導(dǎo)

1、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗指導(dǎo)病原生物與免疫學(xué)教研室實驗一 免疫系統(tǒng)組織和細(xì)胞形態(tài)學(xué)一、 實驗?zāi)康挠^察小鼠胸腺、脾臟等免疫器官及免疫細(xì)胞二、 實驗內(nèi)容 機體免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫分子組成。該系統(tǒng)具有識別和排除抗原性異物、維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和生理平衡的功能，是執(zhí)行體液免疫和細(xì)胞免疫的物質(zhì)基礎(chǔ)。本次實驗主要觀察免疫器官大體解剖學(xué)、免疫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。小鼠是嚙齒目中體形較小的動物，淋巴系統(tǒng)很發(fā)達，包括胸腺、脾臟、淋巴管、外周淋巴結(jié)及腸道派氏集合淋巴結(jié)。本實驗在帶教老師指導(dǎo)下，解剖小鼠，觀察胸腺、脾臟等免疫器官，并制血涂片，觀察小鼠免疫細(xì)胞。（一）小鼠免疫器官解剖學(xué)觀察【材料】動物：昆明種小白鼠。試

2、劑：3%來蘇爾水，瑞特氏染液。器材：眼科鑷，眼科剪，玻片?！痉椒ā啃∈竺摼侍幩?，投入盛有3%來蘇爾水的缸內(nèi)，浸泡5分鐘。取出小鼠，仰臥位置于試驗臺上，使動物腹部朝上。以鑷子提起恥骨處皮膚，用剪刀沿正中線直剪開至下頜部，然后鈍性分離皮膚，再把皮膚向四肢剪開。注意觀察腹壁，用剪刀沿正中線自陰部至膈肌為止剪開，觀察腹腔液量及性狀，觀察脾臟。切開膈肌，剪斷胸骨，翻起胸骨，觀察胸腺、心臟及肺臟，胸腺位于小鼠胸腔心臟前上方，內(nèi)有許多大淋巴細(xì)胞（即前胸腺細(xì)胞）及特定的上皮網(wǎng)狀細(xì)胞（分泌胸腺激素）。解剖結(jié)束，深埋動物。（二）免疫細(xì)胞的形態(tài)觀察【材料】動物：昆明種小白鼠。試劑：3%來蘇爾水，瑞特氏染液，pH8.

3、6硫酸鹽緩沖液，20%鹽酸甲醇。器材：眼科鑷，眼科剪，玻片?！痉椒ā繙?zhǔn)備潔凈玻片兩張，一張用于推片，另一張用于固定標(biāo)本。剪斷小鼠尾巴取血或小鼠眼球取血，迅速在玻片上涂血膜制備血涂片，自然干燥。瑞氏染色（）染色：甲醇固定標(biāo)本分鐘（亦可省略），滴加瑞氏染液數(shù)滴覆蓋血膜，染色分鐘，再加等量的pH8.6硫酸鹽緩沖液或新制蒸餾水，用洗耳球吹打，使之與染液混勻，靜置染色810分鐘，棄去染料，水洗。（）脫色：用20%鹽酸甲醇脫色，肉眼觀察玻片呈粉紅色為宜，顯微鏡下觀察結(jié)果。細(xì)胞特征細(xì)胞：細(xì)胞是由胸腺內(nèi)的淋巴干細(xì)胞分化而成的，是淋巴細(xì)胞中數(shù)量最多、功能最復(fù)雜的一類細(xì)胞，占外周血液淋巴細(xì)胞總數(shù)的75%80%。細(xì)

4、胞體積較小，胞質(zhì)少，核呈圓形，常在一側(cè)有小凹陷，染色質(zhì)呈塊狀，較致密，故著色較深。多數(shù)細(xì)胞壽命較長，可存活數(shù)月至數(shù)年或更長。在抗原刺激下，細(xì)胞經(jīng)過多次分裂增殖，形成效應(yīng)性細(xì)胞。效應(yīng)性細(xì)胞的存活期短，具有殺傷靶細(xì)胞的能力，但必須與靶細(xì)胞結(jié)合才能產(chǎn)生免疫效應(yīng)。細(xì)胞：細(xì)胞由骨髓中的淋巴干細(xì)胞分化而成，占血中淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%15%，數(shù)量較少。細(xì)胞體積比淋巴細(xì)胞略大。細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，在光鏡下與細(xì)胞難以區(qū)別。細(xì)胞生存期一般較短，可存活數(shù)周或數(shù)月，也有壽命長達數(shù)年的。當(dāng)細(xì)胞受到抗原刺激后，增殖分化為大量漿細(xì)胞。漿細(xì)胞可合成和分泌抗體（免疫球蛋白），抗體在血液中循環(huán)。通過抗體與抗原結(jié)合，可中和毒素，抑制細(xì)菌或

5、靶細(xì)胞的代謝，溶解靶細(xì)胞，從而清除相應(yīng)抗原并促進巨噬細(xì)胞吞噬抗原。NK細(xì)胞：自然殺傷細(xì)胞，由骨髓中淋巴干細(xì)胞分化而來，占血中淋巴細(xì)胞總數(shù)的2%5%，在人體內(nèi)分布廣泛，以外周血和脾、淋巴結(jié)中NK細(xì)胞活性最高。在中空器官的管壁固有層和一些實質(zhì)性器官的間質(zhì)中，均有NK細(xì)胞存在。在骨髓中NK細(xì)胞活性較低。NK細(xì)胞是大淋巴細(xì)胞，平均直徑為1215，胞質(zhì)較多，在胞質(zhì)內(nèi)有許多大小不等的嗜天青顆粒，故又稱大顆粒淋巴細(xì)胞，核呈卵圓形。NK細(xì)胞不需抗原激活，更不需抗體的協(xié)助，它可直接殺傷靶細(xì)胞，例如殺傷被病毒感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，NK細(xì)胞的這種抗感染和抗腫瘤的殺傷作用是廣譜的。DC：樹突狀細(xì)胞，是一類形狀不規(guī)則的

6、非單核吞噬系統(tǒng)細(xì)胞，特點是胞漿有許多長突起呈觸須狀，使整個細(xì)胞的形態(tài)像一個蜘蛛。樹突狀細(xì)胞分散于全身的上皮組織和實質(zhì)性器官，其細(xì)胞數(shù)量不超過局部細(xì)胞總數(shù)的1%；也可遷移到血液和淋巴，其數(shù)量不超過血液有核細(xì)胞總數(shù)的0.1%。樹突狀細(xì)胞的吞噬能力較弱，但細(xì)胞表面積大，且有豐富的MHC類分子，所以捕獲抗原和遞呈抗原的能力很強。單核巨噬細(xì)胞：單核細(xì)胞發(fā)生于骨髓的多能干細(xì)胞，循環(huán)于血液中，穿透血管內(nèi)皮進入組織內(nèi)，轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞。單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)在體內(nèi)分布廣，細(xì)胞數(shù)量多，主要分布于疏松結(jié)締組織、肝、脾、淋巴結(jié)、骨髓、腦、肺以及腹膜等處，并依其所在組織的不同而有不同的名稱。單核細(xì)胞一般為圓形，直徑約1020

7、；巨噬細(xì)胞大小不等，直徑約1030或更大，常有偽足，呈多形性。單核巨噬細(xì)胞有腎形或馬蹄形的核，胞漿中富含溶酶體及其他各種細(xì)胞器。中性粒細(xì)胞：占白細(xì)胞總數(shù)的50%70%，是白細(xì)胞中數(shù)量最多的一種細(xì)胞。細(xì)胞呈球形，直徑1012，核染色質(zhì)呈團塊狀。核的形態(tài)多樣，有的呈臘腸狀，稱桿狀核；有的呈分葉狀，葉間有細(xì)絲相連，稱分葉核。細(xì)胞核一般為25葉，正常人以23葉者居多。中性粒細(xì)胞的胞質(zhì)染成粉紅色，含有許多細(xì)小的淡紫色及淡紅色顆粒，顆?？煞譃槭忍烨囝w粒和特殊顆粒兩種。嗜天青顆粒較少，呈紫色，約占顆?？倲?shù)的20%，光鏡下著色略深，體積較大。特殊顆粒數(shù)量多，淡紅色，約占顆?？倲?shù)的80%，顆粒較小，直徑0.30

8、.4，呈啞鈴形或橢圓形，內(nèi)含堿性磷酸酶、吞噬素、溶菌酶等。吞噬素具有殺菌作用，溶菌酶能溶解細(xì)菌表面的糖蛋白。中性粒細(xì)胞具有活躍的變形運動和吞噬功能。嗜酸性粒細(xì)胞：占白細(xì)胞總數(shù)的0.5%3%。細(xì)胞呈球形，直徑1015，核常為葉，胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大（直徑0.51.0）、均勻、略帶折光性的嗜酸性顆粒，染成桔紅色。電鏡下，顆粒多呈橢圓形，有膜包被，內(nèi)含顆粒狀基質(zhì)和方形或長方形晶體。顆粒含有酸性磷酸酶、芳基硫酸酯酶、過氧化物酶和組胺酶等，因此它也是一種溶酶體。嗜酸性粒細(xì)胞也能做變形運動，并具有趨化性。它能吞噬抗原抗體復(fù)合物，釋放組胺酶滅活組胺，從而減弱過敏反應(yīng)。嗜酸性粒細(xì)胞還能借助抗體與某些寄生蟲表面結(jié)合，

9、釋放顆粒內(nèi)物質(zhì)，殺滅寄生蟲。故嗜酸性粒細(xì)胞具有抗過敏和抗寄生蟲作用。嗜堿性粒細(xì)胞：數(shù)量最少，占白細(xì)胞總數(shù)的015%。細(xì)胞呈球形，直徑1012。胞核分葉呈形或不規(guī)則形，著色較淺。胞質(zhì)內(nèi)含有嗜堿性顆粒，大小不等，分布不均，染成藍(lán)紫色，可覆蓋在核上，顆粒具有異染性，甲苯胺藍(lán)染色呈紫紅色。.紅細(xì)胞與血小板：紅細(xì)胞直徑78.5，呈雙凹圓盤狀，中央較薄，周緣較厚，故在血涂片標(biāo)本中呈中央染色較淺、周緣染色較深。血小板是骨髓中巨核細(xì)胞胞質(zhì)脫落下來的小塊，故無細(xì)胞核，表面有完整的細(xì)胞膜。血小板體積甚小，直徑24，呈雙凸扁盤狀；當(dāng)受到機械或化學(xué)刺激時，則伸出突起，呈不規(guī)則形。在血涂片中，血小板常呈多角形，聚集成群

10、。血小板中央部分有藍(lán)紫色的顆粒，稱顆粒區(qū)；周邊部呈均質(zhì)淺藍(lán)色，稱透明區(qū)。實驗二、小鼠血腦屏障觀察一、 實驗?zāi)康?、掌握血腦屏障驗證實驗的操作過程2、了解血腦屏障的作用二、實驗內(nèi)容血腦屏障是機體的屏障結(jié)構(gòu)的重要組成部分。血腦屏障主要由軟腦膜、脈絡(luò)叢、腦毛細(xì)血管和星狀膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成。該組織結(jié)構(gòu)致密，病原菌及其它大分子物質(zhì)不易通過，故能保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)。嬰幼兒因血腦屏障尚未發(fā)育完善，故較易發(fā)生腦膜炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染?！静牧稀縿游铮豪ッ鞣N小白鼠。試劑：5%的臺盼藍(lán)水溶液，無菌生理鹽水。器材：眼科鑷，眼科剪，剪刀?！痉椒ā繉?%的臺盼藍(lán)水溶液經(jīng)尾靜脈分別注入兩只小白鼠體內(nèi)，每只0.7mL，其中一只顱內(nèi)注

11、射無菌生理鹽水0.1mL。510分鐘后觀察小白鼠皮膚、眼、嘴等的顏色變化。于3060分鐘后，見小白鼠眼、嘴呈藍(lán)色，即窒息死亡，腹部朝下固定。由頭部到尾部沿背中線剪開皮膚，暴露皮下、肌肉和內(nèi)臟，觀察顏色變化。小心剖開顱骨椎管，暴露腦和脊髓，與皮下、肌肉和內(nèi)臟相比，并比較兩只小鼠有何不同。實驗三、 吞噬細(xì)胞功能檢測一、 實驗?zāi)康恼莆胀淌杉?xì)胞功能測試的操作過程及意義二、 實驗內(nèi)容體內(nèi)具有吞噬功能的細(xì)胞群按其形態(tài)的大小分兩類：一類為大吞噬細(xì)胞，即組織中的巨噬細(xì)胞和血液中的大單核細(xì)胞。它們對異物有吞噬和消化的功能，在機體非特異性免疫、特異性免疫和免疫調(diào)節(jié)中有重要的作用，因此，通過測定吞噬細(xì)胞的吞噬作用可

12、判斷機體的免疫力。另一類為小吞噬細(xì)胞，即中性粒細(xì)胞。中性粒細(xì)胞的功能包括粘附、移動、吞噬殺菌等，是機體天然免疫力的重要組成部分。（一）中性粒細(xì)胞吞噬功能的測定【材料】試劑：白色葡萄球菌，肝素溶液，甲醇，堿性美藍(lán)染液。器材：血紅蛋白吸管，凹玻片，載玻片，1mL注射器及26號針頭，采血針，酒精棉球等?！痉椒ā烤旱闹苽鋵咨咸亚蚓臃N于肉湯培養(yǎng)基中，放37溫箱內(nèi)培養(yǎng)12左右；置100水浴中加熱10min，殺死細(xì)菌，用無菌生理鹽水稀釋成每毫升6108個細(xì)菌備用。試驗方法用血紅蛋白吸管吸取受試者耳垂或指血40uL，立即加入盛有20uL肝素（濃度為20/mL）的潔凈凹玻片的凹孔內(nèi)，輕輕攪動混勻，再加上

13、述葡萄球菌菌液20uL充分混勻。然后置入鋪有濕紗布的有蓋容器內(nèi)（此容器先放37溫箱中預(yù)溫），在37溫箱中作用30min，其間每隔10min搖勻一次。作用完畢，取小滴混合液置于潔凈無油污的載玻片一端，推成薄片。待干后，用甲醇固定45min，堿性美藍(lán)液染23min，置油鏡下觀察。隨機計數(shù)100個中性粒細(xì)胞，分別記錄發(fā)生吞噬和未吞噬的白細(xì)胞數(shù)，對有吞噬作用的白細(xì)胞，應(yīng)同時記錄所吞噬的細(xì)菌數(shù)。結(jié)果表示方法（）吞噬細(xì)胞（%）：即100個中性粒細(xì)胞中吞噬有細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)；（）吞噬指數(shù)：將100個中性粒細(xì)胞所吞噬的細(xì)菌總數(shù)除以100，得到每個白細(xì)胞吞噬細(xì)菌的平均數(shù)，即為吞噬指數(shù)。臨床應(yīng)用一般多用于病人治療前后

14、白細(xì)胞吞噬指數(shù)與百分率的動態(tài)變化，作為觀察療效和判斷預(yù)后的參考指標(biāo)?！咀⒁馐马棥勘痉汕宄赜^察到中性粒細(xì)胞的清理作用，但作為科研指標(biāo)，客觀性差，不宜采用。（二）巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗【材料】動物：昆明種小白鼠。試劑：%雞血球，%面粉或淀粉肉湯，瑞特氏染液。器材：無菌注射器及針頭，玻片。【體內(nèi)方法】于實驗24小時前，在小鼠腹腔內(nèi)注射1mL淀粉肉湯。次日重復(fù)注入淀粉肉湯1mL，經(jīng)過1小時后再給小鼠腹腔內(nèi)注入1%雞血球懸液1mL。血球注射后1小時，用注射器抽取小鼠腹腔滲出液做涂片，自然干燥后，進行瑞氏染色（方法同前）。用油鏡觀察巨噬細(xì)胞漿內(nèi)有無被吞噬的雞紅細(xì)胞，并進行計數(shù)。結(jié)果：（）吞噬百分率：

15、油鏡下觀察100個巨噬細(xì)胞，計算吞噬百分率，以表示吞噬細(xì)胞的吞噬功能。正常值為60%左右。（）吞噬指數(shù)。按下列公式算出吞噬指數(shù)（即每個吞噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的平均數(shù)）：吞噬指數(shù)100個巨噬細(xì)胞中所吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/100（）吞噬雞紅細(xì)胞的等級觀察：借以判定巨噬細(xì)胞吞噬和消化功能，級表示吞噬功能，、級表示消化功能強弱。級：被吞噬的雞紅細(xì)胞完整，未消化，胞漿淺紅或淺黃帶綠色，胞漿淺紫紅色。級：輕度消化，胞漿淺黃綠色，核固縮，染成紫藍(lán)色。級：重度消化，胞漿淡染，胞核呈淺灰黃色。級：完全消化，巨噬細(xì)胞內(nèi)僅見形態(tài)類似雞紅細(xì)胞大小的空泡，邊緣整齊，胞核隱約可見?！咀⒁馐马棥侩u紅細(xì)胞呈橄欖球形，有清楚的細(xì)胞

16、核，亦呈橄欖球形，染色后清晰可見，容易與小白鼠的紅細(xì)胞相區(qū)別。本實驗的觀察指標(biāo)是吞噬百分率、吞噬指數(shù)，這兩個指標(biāo)是主觀指標(biāo)，客觀性差。實驗四、紅細(xì)胞粘附功能測定一、 實驗?zāi)康?掌握紅細(xì)胞粘附功能測定的方法及意義二、 實驗內(nèi)容（一）花環(huán)法測定紅細(xì)胞CD35分子紅細(xì)胞膜上3b受體（CD35）可與補體致敏的酵母菌粘附形成花環(huán)（RBC3b花環(huán)）；紅細(xì)胞膜上粘附的中3b分子可與未致敏的酵母菌粘附形成花環(huán)（花環(huán)）。RBC3b和RBCIC花環(huán)率可作為紅細(xì)胞免疫粘附功能的指標(biāo)，如二項指標(biāo)都低下，判為原發(fā)性紅細(xì)胞免疫功能低下，為紅細(xì)胞膜3b受體受到破壞和影響所致；如果RBC3b花環(huán)率降低，而RBCIC花環(huán)率增高

17、，為繼發(fā)性紅細(xì)胞免疫功能低下，是由于CIC增加，紅細(xì)胞粘附IC過多引起的。此兩項試驗可作為臨床上免疫性疾病的療效及預(yù)后檢測指標(biāo)，亦可作為器官移植、疾病發(fā)病機理與藥物篩選的紅細(xì)胞免疫指標(biāo)，以及用于中醫(yī)中藥作用的免疫學(xué)研究?！静牧稀縿游铮豪ッ鞣N小白鼠。試劑：肝素，生理鹽水，酵母菌，0.25%戊二醛。器材：離心機，細(xì)胞計數(shù)板，二層定性濾紙，光學(xué)顯微鏡，試管，水浴箱，玻片?！痉椒ā恐苽浯郎y紅細(xì)胞懸液：將肝素抗凝的血用生理鹽水洗滌離心3次，2000/min離心35min，計數(shù)后配成1108/mL紅細(xì)胞懸液備用。酵母菌培養(yǎng)：取酵母菌菌種接種于沙保培養(yǎng)基，28培養(yǎng)24即可。制備補體致敏的酵母菌懸液：將酵母菌

18、用生理鹽水洗滌3次后，配成%懸液，水浴內(nèi)煮沸20min，充分混勻。用二層定性濾紙（或16層紗布）過濾，除去小凝塊，在低倍鏡下呈單個酵母菌細(xì)胞分散狀態(tài)，加等量小白鼠血清，混勻后置37水浴致敏15min。用生理鹽水洗滌次，2500/min離心10min。去盡上清，用生理鹽水重混懸。計數(shù)后配成110/mL補體（C3）致敏的酵母菌懸液。取兩支小試管，每管加待測紅細(xì)胞懸液100uL，第一管再加補體致敏酵母菌懸液100uL，第二管加未致敏的酵母菌懸液100uL，搖勻放37水浴30min；取出用手腕輕輕搖勻，加生理鹽水200uL；混勻后，再加0.25%戊二醛75uL輕輕混勻；分別取1/3量水平涂片，吹干，加

19、甲醇固定；用瑞氏法染色，油鏡下計數(shù)。紅細(xì)胞上粘附2個或2個以上酵母菌者為花環(huán)。分別計數(shù)200個紅細(xì)胞，算出花環(huán)陽性細(xì)胞百分率。第一管為RBCC3b受體花環(huán)率，第二管為RBCIC花環(huán)率?！咀⒁馐马棥拷湍妇稚⒉荒茏阅?，要充分吹打分散。水浴時防止紅細(xì)胞破壞。細(xì)胞計數(shù)要準(zhǔn)確，紅細(xì)胞與酵母菌比例要合適。（二）紅細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞免疫粘附能力的測定腫瘤細(xì)胞可通過旁路途徑激活并粘附補體，與紅細(xì)胞C3b受體結(jié)合，紅細(xì)胞還可識別腫瘤抗原與腫瘤細(xì)胞粘附，攻擊癌細(xì)胞，形成花環(huán)狀。這為研究腫瘤病人紅細(xì)胞與血清中補體樣物質(zhì)共同殲滅腫瘤細(xì)胞能力的變化規(guī)律及機理提供了有力的手段?！静牧稀縿游铮豪ッ鞣N小白鼠。試劑：0.25%

20、戊二醛，生理鹽水，腫瘤細(xì)胞。器材：試管，玻片，吸管，離心機，水浴箱，100uL加樣器。【方法】靶細(xì)胞準(zhǔn)備：靶細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞，經(jīng)生理鹽水洗滌一次，1000/min離心min后，配成110/mL懸液。制備新鮮血清和待測紅細(xì)胞懸液：小鼠眼球取血，其中一只取出的血置于加了肝素的試管中，然后水平離心2000/10min后，取上清即為小鼠新鮮血清；另一只取出的血直接置于試管中，用生理鹽水洗滌3次（每次水平離心2000/5min），制備成110/mL待測紅細(xì)胞懸液。3 測紅細(xì)胞免疫粘附活性，采用“直向腫瘤紅細(xì)胞花環(huán)實驗”：取小鼠新鮮血清100uL加腫瘤細(xì)胞懸液100uL混勻，放37水浴30min；用生理鹽水

21、洗滌一次，水平離心/5min后，加待測紅細(xì)胞懸液50uL混勻，放37水浴30min；取出加100uL生理鹽水混勻后，再加0.25%戊二醛50uL混勻，水平涂片，瑞氏染色。腫瘤細(xì)胞呈藍(lán)色，紅細(xì)胞呈紅色，腫瘤細(xì)胞粘附上3個或3個以上紅細(xì)胞者為花環(huán)，計數(shù)100個癌細(xì)胞，算出花環(huán)率。【注意事項】計數(shù)細(xì)胞時要準(zhǔn)確，紅細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞比例要合適。水浴時避免水致紅細(xì)胞破壞。戊二醛加入前后都應(yīng)輕輕混合，避免假花環(huán)出現(xiàn)。實驗五、凝集反應(yīng)一、 實驗?zāi)康恼莆漳磻?yīng)的原理及常用方法二、實驗內(nèi)容【原理及意義】顆粒性抗原（如細(xì)菌、細(xì)胞）與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，在適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)環(huán)境中形成肉眼可見的凝集塊的現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)。包

22、括直接凝集反應(yīng)（細(xì)菌或細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象）和間接凝集反應(yīng)（將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，再與相應(yīng)抗體發(fā)生反應(yīng)出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象）。凝集反應(yīng)廣泛地應(yīng)用于疾病的診斷和各種抗原性質(zhì)的分析。（一）直接凝集反應(yīng)（1）玻片凝集反應(yīng)鑒定細(xì)菌【材料】試劑：110稀釋的傷寒桿菌診斷血清，傷寒桿菌、痢疾桿菌24小時瓊脂斜面培養(yǎng)物，生理鹽水。器材：玻璃蠟筆，載玻片，毛細(xì)吸管?！痉椒ā咳∏鍧嵅Ｆ粡垼孟灩P劃為三格，并注明號碼。無菌操作下，用接種環(huán)于1、2格內(nèi)加110稀釋傷寒桿菌診斷血清12滴，第三格加12滴生理鹽水。無菌操作下，用接種環(huán)取傷寒桿菌培養(yǎng)物少許，混于第三格中，再混于第

23、一格中（不能先混于第一格再混于第三格，因為這樣將使診斷血清混入鹽水而影響對照結(jié)果），將細(xì)菌與鹽水或血清混合均勻使呈乳狀液。此時取菌量不可過多，使懸液呈輕度乳濁即可。同法取痢疾桿菌培養(yǎng)物少許，于第二格內(nèi)混勻。輕輕搖動玻片，經(jīng)12分鐘后肉眼觀察，出現(xiàn)乳白色凝集塊者，即為陽性反應(yīng)；仍為乳濁液者，即為陰性反應(yīng)。（2）玻片凝集反應(yīng)鑒定血型血型系統(tǒng)可分為四種血型：型、型、型和型。血型系統(tǒng)中有、兩種凝集原，紅細(xì)胞膜上含凝集原者稱為型血，含凝集原者稱為型血，同時含、兩種凝集原者稱為型血，無、凝集原者稱為型血。同時，在人類血清中含有與上述凝集原相對應(yīng)的天然凝集素，即抗體。血型鑒定是用已知的標(biāo)準(zhǔn)型血清（含凝集素）

24、和型血清（含凝集素），分別與被鑒定人的紅細(xì)胞相混合，依其發(fā)生凝集反應(yīng)的結(jié)果判定被鑒定人紅細(xì)胞表面所含的凝集原而確定的。在正常情況下，血型系統(tǒng)中只有相同血型的人才能進行輸血，僅在無法得到同型血液的特殊情況下，才可考慮將型血輸給其他血型的人，而且限定在300mL以內(nèi)，并且應(yīng)緩慢輸入?！静牧稀吭噭簶?biāo)準(zhǔn)血清，標(biāo)準(zhǔn)血清，酒精棉球，無菌干棉球。器材：玻璃蠟筆，載玻片，采血針，毛細(xì)吸管?！痉椒ā咳∏鍧嵅Ｆ粡?，用蠟筆劃為二格，注明號碼，并分別滴加標(biāo)準(zhǔn)血清和標(biāo)準(zhǔn)血清各一滴。無菌操作下，用采血針收集受試者耳垂或指端外周血0.51mL。分別滴加受試者外周血一滴。輕輕搖動玻片，經(jīng)12分鐘后肉眼觀察。如兩者均凝集則

25、為型血，均不凝集則為型血，標(biāo)準(zhǔn)血清凝集而標(biāo)準(zhǔn)血清不凝集則為型血，標(biāo)準(zhǔn)血清不凝集而標(biāo)準(zhǔn)血清凝集則為型血。（3）試管凝集反應(yīng)【材料】試劑：110稀釋的傷寒診斷血清，菌液（傷寒桿菌“”菌液，傷寒桿菌“”菌液），生理鹽水。器材：試管架，小試管，吸管，玻璃蠟筆?！痉椒ā咳崈粜≡嚬?4只分兩排排列于試管架上，每排7只依次用蠟筆注明號碼，于每管中分別加入0.5mL生理鹽水。在第1排第1管中加入110稀釋傷寒桿菌“”血清0.5mL，再加入生理鹽水0.5mL于管內(nèi),連續(xù)吹吸3次，使血清與鹽水充分混合，而后吸出0.5mL注入第2管，同樣再加入生理鹽水0.5mL于管內(nèi)予以混勻后吸出0.5mL注入第3管。依次類推，

26、稀釋到第6管，自第6管吸出0.5mL棄去。此時，自第1管至第6管的血清稀釋倍數(shù)依次為120，140，180，1160，1320，1640。第7管不加血清作為對照。同法用吸管吸取110稀釋傷寒桿菌“”血清加入第2排第1管，并依次如上法予以稀釋。用移液管吸取傷寒桿菌“”菌液0.5mL分別加入第1排各管中，此時血清稀釋倍數(shù)又增加了一倍。同法于第2排各管中分別加入傷寒桿菌“”菌液0.5mL。將各管振蕩混勻，放37水浴箱中24小時或37孵育箱中過夜次日取出觀察結(jié)果。【觀察結(jié)果】觀察之前切勿搖動試管，以免凝集塊分散。先觀察對照管，此管應(yīng)無凝集現(xiàn)象，管內(nèi)液體仍成混濁狀態(tài)。但如放置時間較長，細(xì)菌堆于管底成小圓

27、點狀，為陰性反應(yīng)。試驗管應(yīng)自第管觀察起，如有凝集時則于管底有不同大小的圓片狀邊緣不整齊的凝集物，上液則澄清透明或不同程度混濁。凝集的強弱可用“”號表示如下：“”凝集很強，管內(nèi)液體完全澄清，凝集塊完全沉于管底；“”凝集強，管內(nèi)液體不完全澄清，稍有輕度混濁，凝集塊沉于管底；“”凝集中等強度，液體半澄清，凝集塊沉于管底；“”凝集弱，管內(nèi)液體混濁，少量凝集塊沉于管底；“”不凝集，管內(nèi)液體和對照管同樣混濁，無凝集塊。最后輕輕振蕩各管，觀察凝集塊的狀態(tài)，對照管的細(xì)菌在振蕩時呈煙霧狀上升，隨即消散，細(xì)菌分散仍呈混濁狀態(tài)。“”菌液的凝集塊疏松呈棉狀，大片沉于管底，輕搖即升起，并極易破碎?！啊本耗示o密顆粒

28、狀，沉于管底堅實致密，輕輕振搖不易升起，凝集顆粒較小不易搖碎。記錄觀察的結(jié)果并判定凝集效價，通常以能產(chǎn)生明顯凝集（）的血清最大稀釋倍數(shù)作為該血清的凝集效價。如血清的最低稀釋度（即第1管140）仍無凝集，應(yīng)報該血清效價低于140。如血清的最高稀釋度（即第6管11280）仍顯完全凝集現(xiàn)象，應(yīng)報該血清效價高于11280。（二）間接凝集抑制試驗【原理及意義】若使可溶性抗原與相應(yīng)抗體先充分反應(yīng)再加入有關(guān)的免疫微球，因抗體已被可溶性抗原結(jié)合，不再出現(xiàn)免疫微球的被動凝集現(xiàn)象，叫間接凝集抑制試驗，臨床化驗檢查中常用的免疫妊娠試驗就是一種間接凝集抑制試驗。妊娠試驗：孕婦尿中絨毛膜促性腺激素（HCG）的含量比正常

29、尿中的高。妊娠尿中加入抗絨毛膜促性腺激素抗體時，由于發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果，抗體被消耗，此時再往尿中加入乳膠抗原（吸附有人類絨毛膜促性腺激素的乳膠顆粒），不再發(fā)生反應(yīng)，抗原仍呈乳狀液體，即為妊娠試驗陽性。反之，被檢尿中絨毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）不足以把加入的抗體消耗，當(dāng)乳膠抗原加入后，抗體便與抗原結(jié)合發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)均勻細(xì)小顆粒，妊娠試驗為陰性?！静牧稀吭噭何接腥祟惤q毛膜促性腺激素的乳膠抗原，抗人類絨毛膜促性腺激素抗體血清，孕婦尿，正常尿。器材：黑反應(yīng)板，玻璃蠟筆，滴管。【方法】取清潔玻片一張，用蠟筆劃為二格，注明號碼，并分別滴加妊娠尿和正常尿各一滴。分別滴加含抗人類絨毛膜促性腺激

30、素抗體血清各一滴，輕輕搖動，充分混勻。分別滴加一滴乳膠抗原，緩慢搖動35分鐘，觀察結(jié)果：不出現(xiàn)凝集者為陽性，其尿中含有HCG，表示妊娠；出現(xiàn)凝集者為陰性，其尿中不含有HCG，表示未妊娠。【注意事項】試驗材料、用具使用前使其溫度接近室溫（20左右）。被檢尿太混濁，需要過濾。尿中有蛋白及血液時，不宜進行此試驗。實驗六、 酶聯(lián)免疫吸附試驗一、 實驗?zāi)康?、掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的基本原理2、熟悉酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的操作過程二、實驗內(nèi)容酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。它具有

31、較好的特異性，易觀察結(jié)果，便于大規(guī)模檢測。將已知抗原或抗體，吸附在固相載體微孔聚苯乙烯塑料板上，通過抗原抗體特異性結(jié)合吸附待檢樣品中的抗體或抗原后，加酶標(biāo)抗體（酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體或抗原的免疫反應(yīng)的特異性，又不影響酶本身的活性）和底物后，在相應(yīng)酶底物的作用下生成有色物質(zhì)，其顏色深淺與標(biāo)記物中相應(yīng)的抗體或抗原的含量成正比，由此即可測定抗原或抗體的含量。常用的有ELISA雙抗體夾心法（測抗原）和ELISA間接法（測抗體）兩種。ELISA夾心法測定抗原（HBsAg）常用試劑盒分一步法和二步法，二者原理完全相同?！疽徊椒ā繉D中的第步和第步同時進行，允許混合加入，其形成的免疫復(fù)合物，基本

32、不影響目測的結(jié)果，適用于目測結(jié)果。【二步法】如圖中第步和第步由于分步進行，其結(jié)果較準(zhǔn)確，主要用于需要定量檢測時?！静牧稀吭噭篐BsAg診斷試劑盒。器材：酶聯(lián)儀，微量加樣器，吸頭等?！痉椒ā考訕樱好拷M7微孔，待檢4孔，空白對照1孔，陰、陽性對照各1孔。分別加陰、陽性對照1滴和50uL待測樣本于相應(yīng)孔內(nèi)，置37水浴箱溫育30分鐘。加酶：除空白對照孔外，每孔加1滴酶標(biāo)溶液，混勻后封板，置37水浴箱溫育30分鐘。洗滌：用洗滌液（按說明配制）注滿各孔，靜置20秒，甩去洗滌液，重復(fù)4次，最后一次在吸水紙上拍干。顯色：每孔加底物液、各1滴（50uL），輕拍混勻，置37水浴15分鐘，肉眼觀察。終止：每孔加終

33、止液1滴（50uL），輕拍混勻。測定：用酶標(biāo)儀（450nm）測定各孔吸光度OD值（先用空白孔校零），P/N值2.1者判為HBsAg陽性，2.1者判為陰性。實驗七、 流式細(xì)胞儀對人淋巴細(xì)胞亞群的分析一、 實驗?zāi)康牧私饬魇郊?xì)胞儀使用原理及意義二、實驗內(nèi)容流式細(xì)胞儀（FCM）又名熒光激活細(xì)胞分類儀（FACS），是集現(xiàn)代電子物理技術(shù)、激光技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)于一體的先進科學(xué)儀器，具有對細(xì)胞分析和分選的功能。(1)流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分析原理：將待測樣品制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)熒光色素（常用異硫氰酸熒光色素，F(xiàn)ITC）染色后，在氣體壓力的推動下進入充滿鞘液的流動室，

34、在鞘液的約束下細(xì)胞排成單列從50100的噴嘴逐個高速噴出，并被鞘液包繞形成細(xì)胞液柱。當(dāng)細(xì)胞通過激光束檢測區(qū)時，細(xì)胞被激光束照射發(fā)出熒光和散射光，這些光信號被光敏元件接收后轉(zhuǎn)換成電信號，經(jīng)計算機分析和處理可得到細(xì)胞的多種信息參數(shù)。(2)流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選原理：細(xì)胞的分選是通過流束形成含有細(xì)胞的帶電液滴而實現(xiàn)的。在流動室的噴嘴上裝備有一個超聲振蕩壓晶體片，充電后高速振動，使噴出的液流斷裂為均勻的小液滴（小液滴是在對細(xì)胞的熒光和散射光被測量后形成的）。這時給流束一個充電脈沖信號，使整個小液滴充以正負(fù)不同的電荷。當(dāng)帶有不同電荷的細(xì)胞液流經(jīng)一對帶正、負(fù)幾千伏恒定靜電電場的偏轉(zhuǎn)板時，帶電的小液滴就根據(jù)自

35、身所帶的電荷性質(zhì)產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不帶電荷的液滴就進入中間的廢液容器中，從而實現(xiàn)了細(xì)胞的分選，純度可達99%以上，對分選出的細(xì)胞可做進一步的研究。流式細(xì)胞儀具有多參數(shù)性、準(zhǔn)確性、快速性及分選的高純度性等特點，因此在免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、病理學(xué)、藥物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中應(yīng)用非常廣泛。尤其在免疫學(xué)方面，結(jié)合單克隆抗體技術(shù)，在免疫分型分選、腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)測、免疫細(xì)胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面更能起到重要作用，成為現(xiàn)代免疫技術(shù)的重要組成部分?，F(xiàn)以利用流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分析功能進行人淋巴細(xì)胞亞群的分析為例?！静牧稀吭噭焊嗡乜鼓?.4mL，11000稀釋的CD單克隆抗體CD3、CD

36、4、CD8，F(xiàn)ITC羊抗鼠IgG，正常小鼠IgG，細(xì)胞洗液，紅細(xì)胞溶解液，固定液。器材：流式細(xì)胞儀，試管，吸管，離心機等。【方法】取4支試管分別加0.1mL肝素抗凝血。在其中3支試管中分別加CD3、CD4、CD8單克隆抗體各0.1mL作為試驗管；在第支試管中加等量正常小鼠IgG作為對照管。置30溫箱，45min。加入細(xì)胞洗液3mL，1000/min離心2min，反復(fù)2次，洗去未結(jié)合的抗體。搖勻管底沉淀細(xì)胞，加入0.1mLFITC羊抗鼠IgG，置30溫箱，45min。加入紅細(xì)胞溶解液3mL，見紅細(xì)胞懸液變?yōu)檎嫒芤簳r，立即1000/min離心2min。棄去上清液，離心洗滌2次，恢復(fù)體積至0.5mL

37、。加入固定液20uL，上機檢測。流式細(xì)胞儀工作原理示意圖【注意事項】流式細(xì)胞儀要求單個細(xì)胞通過測量區(qū)，對細(xì)胞逐個地進行分析，所以制成的單個細(xì)胞懸液樣品，不能有細(xì)胞團塊和過多的細(xì)胞碎片，因此離心過程中時間不宜過長，次數(shù)不宜過多，以免形成細(xì)胞凝塊。加入試劑后或離心洗滌時，切忌用力吹打或劇烈振搖。全部操作盡可能避光，以免熒光衰減。樣品制備好以后，最好立即上機檢測。實驗八 細(xì)胞凋亡的檢測一、 實驗?zāi)康氖煜ぜ?xì)胞凋亡常用的檢測方法二、實驗內(nèi)容細(xì)胞凋亡（apoptosis）是一種由基因控制的細(xì)胞自主性死亡方式。其發(fā)生誘因及形態(tài)學(xué)特征均有別于壞死，與人類免疫系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)展、神經(jīng)組織發(fā)育、器官的形成、腫瘤的發(fā)生

38、發(fā)展等諸多生物學(xué)現(xiàn)象之間有著密切聯(lián)系，并且是免疫應(yīng)答過程中免疫細(xì)胞的殺傷機制之一。細(xì)胞凋亡的檢測技術(shù)已成為免疫學(xué)檢測的一個重要內(nèi)容。凋亡細(xì)胞具有典型的形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)變化，從這些特點出發(fā)發(fā)展起來的檢測方法有形態(tài)學(xué)鑒定、電泳法、免疫學(xué)方法、流式細(xì)胞術(shù)、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)、靶細(xì)胞DNA片段的定量等。(一)放線菌酮制備大鼠淋巴細(xì)胞凋亡模型【原理及意義】放線菌酮（CHX）是一種蛋白合成抑制劑，可誘導(dǎo)小鼠和大鼠的脾、粘膜免疫系統(tǒng)及淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡。此實驗旨在體外研究淋巴細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征?！静牧稀縿游铮豪ッ鞣N小白鼠，大鼠。試劑：PBS緩沖的4%多聚甲醛或2.5%的戊二醛，放線菌

39、酮（用PBS或生理鹽水配成1mg/mL的濃度，除菌過濾，4冰箱保存）。器材：眼科鑷，眼科剪，剪刀，玻片?！痉椒ā看笫笥靡颐崖樽砗?，從腹腔（靜脈或皮下）給大鼠注射3mg/kg體重CHX。注射2h后，取大鼠脾臟（腸或子宮亦可）等組織，剪成一定大小的組織塊，固定于固定液中。固定組織經(jīng)HE染色作光鏡檢查或電鏡檢查。【結(jié)果】一般在注射后不久就可在脾及其它粘膜免疫系統(tǒng)出現(xiàn)大量凋亡的淋巴細(xì)胞（以淋巴細(xì)胞為主）。經(jīng)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，胞漿呈淡紅色。凋亡細(xì)胞在組織中單個散在分布，表現(xiàn)為核染色質(zhì)致密濃縮，核碎裂等。壞死組織則呈均質(zhì)紅染的無結(jié)構(gòu)物質(zhì)，核染色消失?！咀⒁馐马棥坑捎跈C體內(nèi)巨噬細(xì)胞對凋

40、亡細(xì)胞的清除作用，凋亡細(xì)胞形成的高峰期在3h左右，在5h后組織內(nèi)凋亡細(xì)胞已經(jīng)很少，所以取材最好不要超過4h。另外，放線菌酮的劑量要控制在25mg/kg體重。制備成功的模型一般比較穩(wěn)定。(二)活化誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡檢測【原理及意義】活化誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡（AICD）是免疫調(diào)節(jié)的重要途徑之一。體外研究淋巴細(xì)胞的凋亡將有助于防治因淋巴細(xì)胞過度活化而導(dǎo)致的自身免疫性疾病和免疫損傷。已知IL10、TGF、IFN均可體外誘導(dǎo)或淋巴細(xì)胞凋亡。本試驗重點介紹研究淋巴細(xì)胞凋亡常用的檢測方法。（1）活細(xì)胞懸液吖啶橙熒光染色法【材料】試劑：吖啶橙貯存液（10mg吖啶橙溶解于100mLPBS中，過濾，4避光保存），0

41、.01mol/L、Ph6.8PBS。器材：吸管，試管，玻片，熒光顯微鏡?！痉椒ā恐苽浯龣z活細(xì)胞懸液，濃度約為110/mL。取95uL的細(xì)胞懸液，加5uL的吖啶橙貯存液混勻。吸一滴混合液，點于潔凈玻片上，直接用蓋玻片封片。熒光顯微鏡觀察或避光保存于4，待觀察。【結(jié)果】在熒光顯微鏡下，細(xì)胞核DNA為黃色或黃綠色均勻熒光，細(xì)胞質(zhì)和核仁的RNA為桔黃色或桔紅色熒光。出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的黃綠色染色，甚或見黃綠色碎片。細(xì)胞壞死時，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黃綠色或桔黃色熒光均可減弱或消失。（2）瓊脂糖凝膠電泳法【原理及意義】培養(yǎng)或單細(xì)胞懸液用細(xì)胞裂解液消化細(xì)胞按常規(guī)法提取DNA后，置于含溴化乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，細(xì)胞出現(xiàn)PCD時呈典型的“梯狀”條帶，而壞死時，呈模糊的