HLA配型在致敏受者腎移植中的應用研究

1、HLA配型在致敏受者腎移植中的應用研究【摘要】目的探討人類白細胞抗原（HLA）配型在致敏受者腎移植中的臨床意義。方法應用萊姆德細胞板通過補體依賴微量細胞毒性試驗檢測受者的群體反應性抗體(PRA);應用單抗?jié)癜暹M行供受者HLA-類抗原分型；應用微量序列特異性引物(Micro-SSP)進行HLA-類基因分型。結(jié)果17例受者PRA陽性率為5.1%80%,平均37.9%;按交叉反應組(CREGs)配型原則，供受者HLA CREGs 0,1和2個錯配(MM)者分別為5例(29%)、8例(47%)和4例(24%)，無36個錯配者；而按傳統(tǒng)的HLA-A,B,DR抗原配型原則，其0,1和2MM分別為1例(6%

2、)，1例(6%)和8例(47%),34MM有7例(41%)；術后僅3例發(fā)生急性排斥反應，經(jīng)OKT3治療后逆轉(zhuǎn)，所有受者術后腎功能均恢復正常。結(jié)論交叉反應組配型可顯著提高供受者的HLA相配率；良好的HLA配型對減少致敏受者的腎移植排斥反應、提高移植物存活率具有重要意義。【關鍵詞】人類白細胞抗原;群體反應性抗體;致敏受者;腎移植 A study of HLA matching in sensitized recipients of renal transplantationLI Liuyang,LIN Minzhuan(Medical Department of Hemopurification

3、and Renal Transplantation,Zhujiang Hospital,First Military University,Guangzhou 510282,China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the clinical implication of human leukocyte antigen (HLA) matching in sensitized recipients of renal transplantation.MethodsRecipients panel reactive antibody (PRA) was dete

4、cted by using micro-complement-dependent-lymphocytotoxicity test with Lambda cell tray.Donor and recipient HLA class typing was performed with special monoclonal tray and HLA class gene typing with micro-sequence-specific-primers (Micro-SSP).ResultsPRA positive rate in 17 recipients was 5.1% to 80%

5、with an average of 37.9%;patients with 0,1 or 2 mismatch (MM) of HLA crossreactive antigen group (CREGs) were 5(29%),8 (47%) and 4 (24%) cases respectively according to the rule of CREGs matching and no cases had 3-6MM,however the cases of 0,1 or 2 MM were 1 (6%),1 (6%) and 8 (47%) respectively by t

6、he standard of conventional HLA antigen matching and 7 (41%) cases had 3-4MM.Only 3 patients developed acute rejection and were reversed by OKT3 treatment.Renal function returned normal in all patients.ConclusionsThe possibility of good matching was greatly enhanced by the CREGs matching.Good HLA ma

7、tching plays an important role in reducing the incidence of acute rejection and in improving the survival of renal transplants.【Key words】Human leukocyte antigen；Panel reactive antibody；Sensitized recipients；Kidney transplantation我們通過對受者進行群體反應性抗體(PRA)的動態(tài)監(jiān)測，并按美國國立器官分配中心(UNOS)制定的HLA交叉反應組( CREGs )配型原則進

8、行嚴格的供受者配型1，對致敏受者的腎移植取得了滿意效果。報道如下。材料與方法一、 臨床資料17例等待腎移植的致敏受者，男7例，女10例，年齡2658歲，平均40.7歲。 其中初次移植16例，二次移植1例。二、 PRA的監(jiān)測1.試劑： 萊姆德淋巴細胞板(LCT)購自美國One Lambda公司。 該細胞板共含有20種HLA-A抗原特異性，41種HLA-B抗原特異性和10種HLA-C抗原特異性，并且包含若干空白抗原。2.方法：采用補體依賴微量淋巴細胞毒性試驗。先分離受者血清，然后按每孔1l將血清加入細胞板，室溫孵育30min，每孔加入5l兔補體，繼續(xù)孵育1h，然后熒光染色固定，在倒置熒光顯微鏡下讀

9、板。最后用電腦軟件分析PRA陽性血清中的HLA抗體特異性2。術前每月檢測1次受者的PRA水平，移植1周后每周檢測23次，動態(tài)觀察受者的PRA水平和抗體特異性的變化。三、 HLA分型1.試劑：HLA-類單克隆抗體濕板(SMT72R)和HLA-類DNA分型試劑購自美國One Lambda公司；Taq多聚酶購自德國寶靈曼公司；DNA抽提試劑購自德國QIAGEN公司。2.HLA 類抗原分型:采用單抗一步法。用免疫磁珠分離T淋巴細胞，按每孔2000個細胞加入HLA-類單抗分型濕板，室溫孵育1h，然后熒光染色固定，在倒置熒光顯微鏡下讀板，電腦分析結(jié)果。3.HLA 類DNA分型：采用微量SSP法。用DNA抽

10、提試劑抽提供受者的模板DNA,然后在D-Mix管內(nèi)加2lTaq酶（5IU/l）,混勻后取出10l混合液加入陰性對照管；再取39l抽提的模板DNA加入上述D-Mix管內(nèi)，混勻后在31個含不同引物系列的擴增管中分別加入10l D-Mix混合液。密封擴增管，在PCR儀上擴增。結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)至微量膠孔（25g/L瓊脂糖凝膠）內(nèi)，140150伏特電泳35min，然后在紫外透射儀上觀察并照相，分析軟件分析電泳帶的格局，確定等位基因。結(jié)果一、 移植前受者的HLA致敏狀態(tài)17例PRA陽性受者中，4例PRA50%，占30%。HLA抗體特異性主要包括A1、A2、A3、A11、A24、A26、A29、A31；

11、B7、B13、B37、B44、B48、B51、B55、B58、B60、B61、B62等，這些抗體所對應的抗原都是中國人群中分布頻率較高的HLA抗原。 二、 供受者HLA配型結(jié)果對致敏受者尤其是PRA40%的高致敏受者嚴格按照UNOS制定的CREGs配型原則，并且供者不應有與受者預存的HLA抗體特異性相對應的抗原。如果按照過去HLA抗原配型的原則選擇供者，則為致敏受者尋找相配程度高的供者的機率明顯降低。從表1可以看出，17例受者中HLA-A、B、DR 0，1，2，3和4MM者分別為1例(6%)，1例(6%)，8例(47%)，5例(29%)和2例(12%)，無56MM者；而按交叉反應組配型原則，其

12、CREGs 0，1和2MM者分別為5例(29%)、8例(47%)和4例(24%)，無36MM者。可見，按照交叉反應組配型原則可顯著提高供受者的HLA相配率，其中0表117例致敏受者與供者HLA配型結(jié)果例號受者HLA供者HLA位點錯配數(shù)A,B,DRCREGsA,B,DRCREGsA,B,DRCREGs1A2,11;B40,46;DR81C,2C,7C,21CA2,11;B13,46;DR2,81C,2C,7C,21C202A9,19;B5,17:DR4,62C,5C,10C,21CA2,19;B17;DR32C,10C,21C213A3,19;B7,46;DR2,61C,7C,21CA9,11;

13、B15,46;DR2,61C,2C,21C314A2;B22,46;DR4,62C,7C,21CA2,19;B17,22;DR3,42C,10C,21C325A2,9;B5,46;DR92C,5C,21CA2;B16,46;DR6,92C,8C,21C216A2,19;B17,22;DR3,62C,7C,10C,21CA19;B16,17;DR32C,8C,10C,21C117A9,11;B18,27;DR51C,2C,5C,7CA11,19;B13,40;DR5,71C,7C418A2;B22,46;DR52C,7C,21CA2;B13,15;DR2,52C,7C,21C309A2;B13,

14、46;DR2,52C,7C,21CA2,9;B13,46;DR2,92C,7C,21C2010A2,11;B13,17;DR2,31C,2C,7C,21CA2;B13,15;DR2,52C,7C,21C2111A11;B13,40;DR2,61C,7C,12CA9;B15,40;DR2,52C,7C,21C3212A2,9;B15,16;DR5,92C,8C,21CA2;B40,67;DR5,92C,7C,8C2113A2;B15,46;DR2,92C,21CA9,19;B13,15;DR71C,2C,7C,21C4214A19;B17;DR3,710C,21CA11;B40;DR47C,10

15、C3115A10,11;B15,40;DR2,41C,7C,10C,21CA11;B40;DR47C,10C0016A2,9;B15,40;DR4,62C,7C,21CA2,9;B15,46;DR6,92C,21C2017A2,11;B15;DR2,51C,2C,21CA11;B15,40;DR2,41C,7C,21C22 和1MM者分別提高了23%和41%。 三、 致敏受者的腎移植效果本組17例PRA陽性受者術前均未采取血漿置換等措施清除體內(nèi)預存的HLA抗體，而是按照嚴格的HLA配型篩選供者，由于供者沒有與受者的致敏抗體相對應的抗原，因此術后無超急性排斥反應發(fā)生。術后常規(guī)應用潑尼松(Pred

16、)、硫唑嘌呤(Aza)或霉酚酸酯(MMF)和環(huán)孢素A(CsA)三聯(lián)治療。共有3例在術后1個月內(nèi)各發(fā)生1次急性排斥反應，急性排斥發(fā)生率為17%，應用單克隆抗體OKT3治療后全部逆轉(zhuǎn)，至今未再發(fā)生排斥反應；有2例出現(xiàn)急性腎小管壞死，血液透析維持治療，2周后移植腎開始泌尿，最后腎功能恢復正常而痊愈出院；其余12例均在術后35d腎功能恢復正常，痊愈出院，至今未出現(xiàn)排斥反應。經(jīng)隨訪，17例患者中最長的已存活16個月，最短的已存活4個月，腎功能全部正常。四、受者腎移植術后PRA水平的變化17例致敏受者術后動態(tài)監(jiān)測外周血中的PRA水平，結(jié)果表明所有受者術后的PRA水平都比較穩(wěn)定，基本上與移植前保持在同一水平

17、，說明PRA的存在對移植腎的存活并無明顯影響，其前提是供受者必須有良好的HLA配型。討論一、 檢測PRA對篩選合適供者具有重要意義致敏受者體內(nèi)由于存在多價的抗HLA抗體，如果供者具有與受者預致敏的HLA抗體特異性相對應的人類白細胞抗原，進行腎臟移植時必將發(fā)生超急性排斥反應，導致移植失敗，嚴重者甚至可能危及受者生命3。Martin等4認為高敏受者存在的抗外源性HLA的同種抗體是腎臟移植的高危因素，不僅難以找到交叉配型陰性的供腎，延長患者的等腎時間，而且移植效果不理想。因此，致敏受者的腎移植難度較大，選擇供者應慎重，術前準備要充分。對腎移植受者進行PRA檢測，能準確了解其致敏狀態(tài)，正確判斷其致敏抗

18、體的特異性。只有嚴格按HLA配型原則選擇供者，避開受者預致敏的抗體特異性，才能取得滿意的移植效果。二、 血漿置換應用于致敏受者腎移植的局限性雖然血漿置換或免疫吸附可以清除或降低受者外周血中預存的致敏抗體，但受者體內(nèi)合成和分泌抗體的免疫致敏細胞和免疫記憶細胞并未清除，它們始終存在于受者體內(nèi)，如果再次受到相同抗原刺激，必將發(fā)生再次免疫應答，迅速合成和分泌大量的抗體，從而導致超急和加速性排斥反應的發(fā)生。這可能就是造成血漿置換后交叉細胞毒陰性的致敏受者仍然發(fā)生超急性排斥反應的原因。所以從1998年初開始我們不再給致敏受者進行血漿置換治療，而是把注意力放在為致敏受者尋找HLA配合程度高的供者上。本組17

19、例PRA陽性受者全部未做血漿置換治療，但移植效果非常令人滿意。三、 CREGs配型原則可提高供受者HLA的相配率Thompson等1研究表明，采用CREGs配型原則與采用傳統(tǒng)的抗原配型原則比較，1年和3年移植腎存活率兩組間差異無顯著性，而供受者HLA的相配率卻顯著提高。本組17例致敏受者若按抗原配型原則，其0MM和1MM的相配率均為6%，而按CREGs配型原則，則0MM和1MM的相配率分別提高到29%和47%，其臨床意義是非常顯著的。四、致敏受者腎移植的成功有賴于良好的HLA配型本組17例PRA陽性受者，供受者間按照交叉反應組配型原則，HLA-CREGs錯配數(shù)僅為02MM。由于供受者HLA相配程度高，因此，只有3例在