幽門螺桿菌ahpC基因的克隆與原核表達(dá)

1、幽門螺桿菌ahpC基因的克隆與原核表達(dá) 11-01-06 16:22:00 編輯：studa20 作者：李艷青，段廣才，宋春花，張建光，王淑玲，張衛(wèi)東，郗園林【摘要】 目的 構(gòu)建幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)ahpC基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)并純化Ahp蛋白。方法 用PCR方法從中國分離株MEL-Hp27的染色體DNA中擴(kuò)增出ahpC基因片段，將目的基因插入表達(dá)載體pET-30a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-ahpC。重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測序鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。采用鎳離子親和層析純化蛋白，并用SDS-PAGE鑒定。結(jié)果

2、PCR擴(kuò)增的ahpC基因長度為594bp，經(jīng)酶切和測序分析，插入到載體的基因與GenBank公布的序列相似性達(dá)99%；SDS-PAGE顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)出分子質(zhì)量為23ku的目的蛋白，且產(chǎn)量較高。結(jié)論 成功構(gòu)建了ahpC表達(dá)載體pET30a-ahpC，并在大腸桿菌中高效表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】 幽門螺桿菌；ahpC基因；克?。换虮磉_(dá) ChinaABSTRACT: Objective To construct a prokaryotic expression system of ahpC gene of Helicobacter pylori. Methods The ahpC gene was

3、amplified from Hp chromosomal DNA by PCR technique and cloned into the expression vector pET-30a. The recombinant vector pET30a-ahpC was identified by DNA sequencing and transformed to E.coli BL21 (DE3) for expression under induction by IPTG. The expression product was analyzed by SDS-PAGE. Results

4、PCR product showed that ahpC gene consisted of 594bp. The gene fragment that was inserted into the recombinant vector was identified to GenBank for 99%. SDS-PAGE showed that the induced protein was expressed highly in the host bacterium. Conclusion A prokaryotic high-expression system for ahpC gene

5、has been successfully constructed. It can highly express r-AhpC protein in E.coli.KEY WORDS: Helicobacter pylori; ahpC gene; cloning; gene expression幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)是一種定植于人類胃黏膜的革蘭染色陰性、螺旋狀、微需氧菌，是慢性胃炎、消化性潰瘍的病原體，也與胃腺癌及黏膜相關(guān)性淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)1-4。全世界范圍內(nèi)Hp的感染率超過50%5。Hp是一種對氧敏感的微需氧菌，菌體內(nèi)還有多種抗氧化蛋白，其中烷基過

6、氧化氫物還原酶(Ahp)最為豐富，其作用是通過在高氧化環(huán)境中還原有毒的氫化氧化物來實(shí)現(xiàn)的。Ahp由ahpC基因編碼，是抗氧化酶家族peroxiredoxins(prxs)的成員之一6。本研究利用基因克隆技術(shù)，將編碼Hp ahpC外膜蛋白的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，構(gòu)建重組載體，并在E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)和純化，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料幽門螺桿菌中國分離株MEL-Hp27(簡稱Hp27)及質(zhì)粒pET-30a由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和保存；鎳柱、大腸桿菌DH5、BL21 (DE3)購自創(chuàng)生公司；限制性核酸內(nèi)切酶Nde和Xho、pMD18-T Vector、Protein

7、 marker、T4 DNA連接酶均購自大連TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA marker、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA電泳膠回收、質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。引物合成由北京賽百盛生物工程公司完成，DNA測序由北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司完成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2 方法刮取經(jīng)3d培養(yǎng)的Hp培養(yǎng)板上的Hp，以12000r/min離心1min，取沉淀按細(xì)菌基因組抽提試劑盒操作方法提取Hp DNA。根據(jù)GenBank上公布的Hp ahpC基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件primer5.0設(shè)計(jì)ahpC基因的引物P1和P2。P1的序列為：5-CGCA

8、TATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3，下劃線為Nde酶切位點(diǎn)；P2的序列為：5-CGCTCGAGAAGCTTAATGGAATTT-3，下劃線為Xho酶切位點(diǎn)。 以Hp中國分離株MEL-Hp27基因組DNA為模板，P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94預(yù)變性5min，然后94變性30s，60退火30s，72延伸60s，共循環(huán)35次，最后于72延伸5min。PCR產(chǎn)物以10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察擴(kuò)增結(jié)果并用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物?；厥盏腜CR產(chǎn)物與pMD18-T按照載體與插入DNA的摩爾比為16的比例混合后，置16連接過夜，體系為pMD18-T載體1L、PC

9、R產(chǎn)物2L、雙蒸水2L、連接液5L。經(jīng)藍(lán)白斑篩選鑒定的pMD18T-ahpC和表達(dá)載體pET-30a用Nde和Xho雙酶切，以10g/L瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行膠回收后，用T4DNA連接酶于22進(jìn)行連接，pET-30a片段與插入DNA的摩爾比為1(13)。連接后的重組表達(dá)載體pET30a-ahpC再經(jīng)Nde和Xho雙酶切，以10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將重組載體pET30a-ahpC轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，構(gòu)建的重組工程菌涂布含卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1216h，挑選單菌落接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置37搖床振蕩培養(yǎng)12h。抽提質(zhì)粒，以Nde和Xho雙酶切后，1

10、0g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，DNA堿基序列測定由北京三博志遠(yuǎn)生物有限責(zé)任公司完成。取經(jīng)酶切鑒定構(gòu)建成功的重組工程菌接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37搖床培養(yǎng)至A600達(dá)到0.5時(shí)，加入終濃度為0.3mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，于誘導(dǎo)過程中取樣，同時(shí)作空載體菌對照，采用SDS-PAGE電泳分析重組AhpC的表達(dá)。優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,用UVP凝膠成像系統(tǒng)分析重組蛋白的相對含量。 11-01-06 16:22:00 編輯：studa20將大量誘導(dǎo)的細(xì)菌4 4000g離心收集細(xì)菌，PBS洗菌1次，重懸于純水中，-20過夜后超聲破碎，12000g離心，收集上清及沉淀。使用鎳離子親和層析柱純化融合蛋白

11、，SDS-PAGE電泳檢查蛋白純化效果。2 結(jié) 果2.1 Hp ahpC編碼基因的擴(kuò)增以Hp中國分離株MEL-Hp27基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所獲PCR產(chǎn)物以10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，在600bp附近有單一條帶，片段的大小與預(yù)計(jì)相符(圖1)。2.2 重組載體的酶切鑒定回收幽門螺桿菌ahpC基因的PCR產(chǎn)物，與pMD18-T連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5受體菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選試驗(yàn)挑取白色菌斑擴(kuò)增培養(yǎng)后，提取pMD18T-ahpC質(zhì)粒。經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde和Xho雙酶切切出約600bp片段，回收后與用同樣限制性內(nèi)切酶雙酶切的表達(dá)載體pET-30a連接，獲得陽性重組質(zhì)粒，命名為pET3

12、0a-ahpC。重組質(zhì)粒雙酶切鑒定得到1條約594bp的帶，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相一致(圖2)，第3泳道出現(xiàn)第3條帶，可能是因?yàn)殡p酶切時(shí)間為10h，酶切時(shí)間過長產(chǎn)生的非特異條帶，但對實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響。2.3 ahpC基因序列的分析ahpC基因的測序結(jié)果見圖3。ahpC的堿基測序結(jié)果與GenBank已公布的Hp菌株編碼ahpC基因的序列進(jìn)行同源性比對,其一致性達(dá)99%(590/594),其編碼的氨基酸序列同源性為99%(197/198)。2.4 重組載體在E.coli中的表達(dá)及表達(dá)形式鑒定重組質(zhì)粒pET30a-ahpC轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中獲得重組工程菌，接種LB液體培養(yǎng)基，于37培養(yǎng)至A

13、600達(dá)到0.5時(shí)，加入終濃度為0.2mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4h，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測。可見在Mr 23ku處出現(xiàn)1條新的蛋白帶，與理論預(yù)測值相符(圖4)。2.5 重組表達(dá)蛋白rAhpC的純化可溶性分析目的蛋白主要以可溶性方式存在。選取鎳離子親和層析柱純化蛋白，收集洗脫液，SDS-PAGE電泳檢測洗脫液目的蛋白的分子大小。經(jīng)UVP凝膠成像系統(tǒng)分析，洗脫所得目的蛋白的分子質(zhì)量為23ku(圖5)。3 討 論 大多數(shù)細(xì)胞都具有產(chǎn)生和清除活性氧(ROS)的能力。在正常情況下，活性氧是作為分子氧單電子還原反應(yīng)的不可避免的產(chǎn)物。正常細(xì)胞具有相關(guān)的保護(hù)機(jī)制維持細(xì)胞內(nèi)最低水平的活性氧濃度。而過

14、氧化氫是一種穩(wěn)定的活性氧分子，能夠穿過細(xì)胞膜并且在多種細(xì)胞的生理過程中起著重要的作用，包括蛋白磷酸化、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄因子的活化、DNA合成和細(xì)胞分裂等過程。高濃度過氧化氫對細(xì)胞具有毒性，尤其是能夠?qū)?xì)胞組分造成損傷；而適當(dāng)濃度的過氧化氫可以作為第2信使分子參與信號傳導(dǎo)途徑并調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝。而黃單胞菌中，Ahp和CAT(過氧化氫酶)等共同調(diào)控細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的水平，ahpC突變能引起細(xì)胞內(nèi)過氧化氫水平下降7。黃志剛等5利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了Hp27基因敲除突變株(Hp27cagA)，并利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)Ahp在cagA基因敲除突變株菌體蛋白中表達(dá)下降，可能影響Hp的抗氧化應(yīng)

15、急能力。本研究對編碼Hp小分子外膜蛋白ahpC的基因進(jìn)行克隆，并進(jìn)行序列測定，所得序列與GenBank公布的序列一致性為99%；成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET30a-ahpC，經(jīng)過雙酶切及測序鑒定，結(jié)果與預(yù)測一致；經(jīng)42轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞BL21中；重組工程菌在37使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳可見相對分子質(zhì)量約為23000的目的蛋白；經(jīng)超聲破菌和電泳分析，重組表達(dá)蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。經(jīng)鎳離子親和柱層析純化得到烷基過氧化氫還原酶的重組蛋白。本研究為進(jìn)一步研究烷基過氧化氫還原酶的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1HUSSELL T, ISAACSON PG, CRABTRE

16、E JE, et al. The response of cells from low-grade B-cell gastric lymphomas of mucosa-associated lymphoid tissue to Helicobacter pylori J. Lancet, 1993, 342(8871):571-574.2DE ROSTER E, BUSET M, FERNANDES E, et al. Helicobacter pylori: the link with gastric cancer J. Eur J Cancer Prev, 1994, 3(3):247-

17、257.3YAN J, HU AP, LI Q. Establishment of Helicobacter pylori infection model in Mongolian gerbil J. Zhejiang Daxue Xuebao: Yixueban, 2003, 32(1):21-23.4CHEN XJ, YAN J, MAO YF. Analysis on the vacA dominant genotypes and their nucleotide sequences of Helicobacter pylori isolates in Zhejiang area J. Zhejiang Daxue Xuebao: Yixueban, 2003, 32(1):24-28.5黃志剛，段廣才. 幽門螺桿