軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法實(shí)施細(xì)則

1、軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法實(shí)施細(xì)則1 適用范圍：本細(xì)則適用于各類樣品中軍團(tuán)菌的檢測(cè)鑒定。2 檢測(cè)依據(jù)：國家傳染病診斷標(biāo)準(zhǔn)WS195-2001 軍團(tuán)病診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則 軍團(tuán)病診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則，衛(wèi)生部，2002年上海市衛(wèi)生防疫站1979；衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢驗(yàn)，第一版，上海科技出版社3 設(shè)備與材料3.1 冰箱： 4-20。3.2 恒溫培養(yǎng)箱： 36±1。3.3 振蕩器3.4 顯微鏡 40x 100x3.5 離心機(jī) 12000rpm3.6 架盤藥物天平： 0 g -500g, 精度0.5g。3.7 錐形瓶： 100 mL、500 mL。3.8 滅菌吸管： 1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0

2、.1mL刻度)。3.9 滅菌平皿： 直徑90 mm。3.10 滅菌試管： 16 mm×160 mm.。一般用的是18*180mm3.11 溫水浴箱 ：36±13.12 二氧化碳培養(yǎng)箱：5%CO236±13.13 紫外燈3.14 過濾器4 培養(yǎng)基和試劑4.1 BCYE瓊脂成份：N-2-乙酰胺基-2-氨基乙烷磺酸（ACES） 10.00 克氫氧化鉀片（85%KOH試劑級(jí)） 2.80 克活性炭（Norit A） 1.50 克酵母浸膏（Difco） 10.00 克瓊脂（Difco） 17.00 克-酮戊二酸（單鉀鹽） 1.00 克L-半胱氨酸鹽酸鹽（溶于10毫升蒸餾水中）

3、 0.40 克焦磷酸鐵（溶于10毫升蒸餾水中） 0.25 克蒸餾水 1000 毫升4.2 甘氨酸、萬古霉素、多粘菌素B（GVP）瓊脂成份：除上述每升BCYE瓊脂成份外，再加：甘氨酸 3.00 克萬古霉素 5.00 毫克多粘菌素B 10 萬單位4.3 明膠酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：此培養(yǎng)基的制備，除用明膠（每100ml中加3g）代替瓊脂外，其它同BCYE培養(yǎng)基。4.4 酪氨酸BCYE培養(yǎng)基：在BCYE瓊脂中除去碳粉，再于每升培養(yǎng)基中加0.45g酪氨酸。試驗(yàn)時(shí)劃種平板，于37培養(yǎng)5天觀察結(jié)果。4.5 血平板4.6 無半胱氨酸BCYE平板4.7 1%新配制的四甲基對(duì)苯二胺水溶液4.8 3%新配制的過氧化氫液4.

4、9 1%馬尿酸鈉水溶液5.0 3.5%茚三酮5.1 0.2%亞甲蘭水溶液5.2 10%中性福馬林液5.3 96孔U型（8×12）微孔板和微量移液器（8道及單道）5.4 0.01mol/L pH2.0的鹽酸5.5 0.3mol/l KOH5.6 革蘭氏染色液5.7 軍團(tuán)菌成套診斷血清5 檢驗(yàn)程序（軍團(tuán)菌檢驗(yàn)程序）l 臨床含雜菌的標(biāo)本：痰、肺或其它組織（均用少量蒸餾水調(diào)勻或機(jī)械研磨成均勻的懸液）和氣管灌洗液等標(biāo)本 直接免疫熒光法鏡檢 酸處理或放5030min 必要時(shí)放70保存 劃種GVPC瓊脂平板（36，5%CO2714天）l 血液標(biāo)本： 取5ml血液接種BCYE雙相培養(yǎng)基（36，5%C

5、O2714天）每日將液基 覆蓋斜面一次，如斜面出現(xiàn)生長痕跡劃 種BCYE平板（36、5% CO2714天）,挑選可疑菌落作鑒定。分離血清作血清學(xué)診斷（用間接熒光法或微量凝集試驗(yàn)） l 水樣類標(biāo)本： 水樣（0.5L5L水的離心沉淀物或經(jīng)過濾后的0.22m孔徑濾膜）或水龍頭等處的棉拭子洗液 酸處理或5030min，取0.1ml劃種至瓊脂平板36、5% CO2714天培養(yǎng)后，挑選可疑菌落作鑒定。直接免疫熒光法鏡檢l 菌種初步鑒定：BCYE瓊脂平板上的可疑菌落接種無半胱氨酸的BCYE瓊脂平板36，5%CO237天） 生長 不生長 （從原始平板做革蘭氏片染色鏡檢） 第2天生長 第3天后生長出單個(gè)菌落 的

6、革蘭氏陰性桿菌 陰性桿菌 陽性桿菌或陰性球菌不是軍團(tuán)菌 接種血瓊脂平板 可能是軍團(tuán)菌 不是軍團(tuán)菌 不生長 生長 可能是橡樹嶺軍團(tuán)菌 不是軍團(tuán)菌菌種做進(jìn)一步鑒定6操作步驟6.1 樣品處理6.2 病人培養(yǎng)標(biāo)本加熱處理：將標(biāo)本放50水浴30min，可殺滅大部分雜菌而不影響軍團(tuán)菌的存活。6.3 環(huán)境標(biāo)本(水樣)加酸處理：采集500ml水樣，經(jīng)0.22m孔徑的濾膜抽濾后，將濾膜剪碎，放置于5ml原水樣中混勻，取1ml混勻或研勻的標(biāo)本，加于試管中，并于其中加1ml0.01mol/L pH2.0的鹽酸，充分混勻。然后于室溫中作用515min，再于其中加0.03mol/l KOH若干以中和酸的作用。取0.2m

7、l處理水樣培養(yǎng)。6.4 血清學(xué)試驗(yàn)標(biāo)本于發(fā)病時(shí)和兩周后采血，測(cè)定軍團(tuán)菌抗體效價(jià)，每次采血2毫升（不加抗凝劑）并分離血清。單次采血可在發(fā)病一兩周后。6.5 培養(yǎng)分離軍團(tuán)菌無菌的標(biāo)本材料如胸水，可以在離心沉淀后劃種BCYE瓊脂平板，而污染的材料則應(yīng)先劃種GVPC瓊脂平板，劃種時(shí)應(yīng)先在原始區(qū)濃厚接種，然后再分離單個(gè)菌落。將平板放36 5%CO2培養(yǎng)箱（或燭缸）培養(yǎng)。每日觀察結(jié)果。6.6 生化鑒定 氧化酶試驗(yàn)采用平板法或?yàn)V紙法，即將1%新配制的四甲基對(duì)苯二胺水溶液直接滴在BCYE瓊脂平板上新生長出的菌苔和菌落上，30秒內(nèi)出現(xiàn)明顯深紫色時(shí)為陽性，或直接挑取新鮮菌落揉擦在清潔的白色瀘紙上，再滴加試劑于其上

8、，30秒內(nèi)出現(xiàn)深紫色為陽性。 觸酶試驗(yàn)準(zhǔn)備一管新培養(yǎng)的BCYE斜面培養(yǎng)物，于其中滴加3%過氧化氫液，立即出現(xiàn)大量氣泡者為陽性。也可用鉑絲、小玻棒等挑取少量新鮮生長的菌落或菌苔，研均于盛有少量3%過氧化氫液的清潔試管內(nèi)，立即出現(xiàn)大量氣泡者為陽性。用軍團(tuán)菌營養(yǎng)肉湯的新鮮培養(yǎng)物做懸滴法。觀察時(shí)注意與布朗氏運(yùn)動(dòng)區(qū)別。測(cè)定菌落熒光：將被試菌接種酪氨酸BYE瓊脂平板，待生長出單個(gè)菌落后，在黑暗處以長波（365mm）紫外線照射下，觀察菌落發(fā)出的熒光。 棕色色素產(chǎn)生試驗(yàn)將被試菌劃種酪氨酸BYE瓊脂平板，待生長出單個(gè)菌落后（36培養(yǎng)7天），觀察菌落和菌苔，出現(xiàn)棕色時(shí)為陽性。 馬尿酸水解試驗(yàn)將一滿環(huán)（環(huán)直徑3mm

9、）BCYE瓊脂斜面的生長物，接種于馬尿酸鹽管（內(nèi)含1%馬尿酸鈉水溶液0.4ml）中，使成均勻混濁菌懸液，放36水浴1820小時(shí)，再于其中加入0.2ml茚三酮試劑液（將3.5%比例的茚三酮溶解于按11混合的丙酮與正丁醇中，新鮮使用或黑暗中保存短時(shí)間），放36水浴10min，取出后在20min未接種的馬尿酸鹽管作空白對(duì)照，同樣的條件下，嗜肺軍團(tuán)菌通常于515min形成蘭色（陽性），而一般其它軍團(tuán)菌則于15min后完全無顏色改變。 BCP試驗(yàn)將 0.05%溴甲酚紫水溶液1滴，加在一濾紙?zhí)?，再于BCYE瓊脂上新生長的菌落或菌苔，以接種環(huán)取較大量揉擦于滴過試劑的濾紙?zhí)?，如?min內(nèi)出現(xiàn)綠蘭色，則此試驗(yàn)

10、為陽性；黃色或暗綠色為陰性。6.6.7 測(cè)定內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生試驗(yàn)有多種方法。有條件時(shí)建議采用硝化先鋒霉素（Nitrocefin）紙片法，陽性時(shí)紙片由淡黃色變?yōu)樯罴t色。一般均認(rèn)為此法是最靈敏、準(zhǔn)確和方便的方法。6.6.8 明膠水解試驗(yàn)將待試菌穿刺接種于明膠酶試驗(yàn)培養(yǎng)基管，放22培養(yǎng)至少14天，如出現(xiàn)液化時(shí)為陽性。6.7 血清學(xué)分型鑒定軍團(tuán)菌血清分型鑒定時(shí)采用玻片凝集法，可參照標(biāo)準(zhǔn)分型表判定結(jié)果。如符合以上結(jié)果，可按上表報(bào)告檢出某種軍團(tuán)菌。表1 軍團(tuán)菌科各常見種的表型試驗(yàn)鑒定特征菌株名血清型數(shù)在各種瓊脂上生長氧化酶觸酶動(dòng)力菌落熒光馬尿酸水解BCP斑點(diǎn)棕色素內(nèi)酰胺酶明膠液化BCYE缺半胱氨酸BCYE血平

11、板嗜肺軍團(tuán)菌15+-+/-+/-+-+-+米克戴德軍團(tuán)菌1+-+/-+-+-博杰曼軍團(tuán)菌2+-+藍(lán)白-+/-+杜莫夫軍團(tuán)菌1+-+/-+藍(lán)白-+長灘軍團(tuán)菌2+-+/-+-+/-+約旦軍團(tuán)菌1+-+-+高爾曼軍團(tuán)菌1+-+/-+藍(lán)白-+菲利軍團(tuán)菌2+-+-+/-+/-+/-阿尼沙軍團(tuán)菌1+-+/-+藍(lán)白-+詹姆斯敦軍團(tuán)菌1+-+-+紅光軍團(tuán)菌1+-+紅-+橡樹嶺軍團(tuán)菌1+-/+-+-+/-+ 陽性 陰性 可陰可陽6.8 基因檢測(cè)以全軍團(tuán)菌屬5s rRNA和嗜肺軍團(tuán)菌mip基因的特異序列作為引物，擴(kuò)增片段大小分別為104bp和440bp。核酸的提取及擴(kuò)增（1）已知菌核酸提取：取滅菌雙蒸水0.5ml

12、于離心管中，挑取菌苔少許放入該離心管中振蕩混勻，放置于裂解儀中100裂解10min，取出放入-20速凍，15min后， 12，000rpm，4，離心5min，取上清液，按試劑盒提供的方法操作。（2）水樣中核酸提?。ǖ诙A(yù)處理水樣）：取水樣混懸液1ml于離心管中，10，000rpm，離心5min，取上清液，按試劑盒提供的方法操作。（3）擴(kuò)增條件 預(yù)變性94 5min；94 35sec、55 35sec、72 75sec循環(huán)35次；最后72 延伸3min。 PCR結(jié)果判定 取10l擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，100v，電泳2030min，觀測(cè)結(jié)果。7報(bào)告結(jié)果7.1報(bào)告陽性結(jié)果 檢出軍團(tuán)菌7.

13、2報(bào)告陰性結(jié)果 未檢出軍團(tuán)菌浙江省軍團(tuán)菌病監(jiān)測(cè)方案1976年美國賓夕法尼亞州費(fèi)城，一起流行性爆發(fā)性肺炎使人們陷入極度恐慌中，共221人感染，死亡34例。由于患者主要是退伍軍人，故稱此病為軍團(tuán)菌病。次年找到病原體，并命名為軍團(tuán)菌。以后經(jīng)過不斷研究發(fā)現(xiàn)，此菌廣泛分布于自然界，特別是水中。軍團(tuán)菌有34個(gè)種59個(gè)血清型，其中嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila，Lp)有14個(gè)血清型，是引起人類軍團(tuán)病的主要病原菌。軍團(tuán)菌感染可引起上呼吸道感染樣癥狀、持續(xù)發(fā)熱及其他系統(tǒng)的改變臨床癥狀體征并非特異。軍團(tuán)菌感染主要以肺部炎癥為特征。輕者稱龐地亞克熱（pontiac fever），重者表現(xiàn)以

14、肺部感染為主的全身多臟器損害，即軍團(tuán)菌病。軍團(tuán)菌肺炎容易導(dǎo)致呼吸衰竭、橫紋肌溶解和腎功能衰竭，15%軍團(tuán)菌肺炎可引起出現(xiàn)腎功能衰竭，其中有50%病人最終死于腎功能衰竭。近年來，國外有過多起有關(guān)軍團(tuán)菌肺炎疫情爆發(fā)的報(bào)道，2004年Chrysochou C報(bào)道了一起軍團(tuán)菌肺炎爆發(fā)。2000年發(fā)生比利時(shí)一起軍團(tuán)菌肺炎爆發(fā)疫情，該起疫情為旅行團(tuán)中93例發(fā)生軍團(tuán)菌肺炎的，引起了當(dāng)?shù)卣母叨戎匾暋?996年法國也發(fā)生了一起旅行團(tuán)中爆發(fā)軍團(tuán)菌肺炎。我國在1981年發(fā)現(xiàn)首例病人，隨后又在肺炎病人痰和空調(diào)系統(tǒng)冷卻塔水中分離出軍團(tuán)菌。血清流行病學(xué)證實(shí)，我國南京、廣州、天津，等地均有軍團(tuán)菌感染。不僅如此，據(jù)國內(nèi)外

15、報(bào)道在家禽家畜中也廣泛存在軍團(tuán)菌感染，目前已在多種動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)軍團(tuán)菌，發(fā)生感染并引起疾病。軍團(tuán)菌引起肺炎癥狀，在臨床上容易與SARS、禽流感和其他不明原因發(fā)熱和肺炎相混淆。而且軍團(tuán)菌由于缺乏典型的臨床體征以及治療的特殊性，其實(shí)驗(yàn)室確診顯得尤為重要。但軍團(tuán)菌人工培養(yǎng)條件的苛刻及其生長代謝的緩慢導(dǎo)致臨床與環(huán)境標(biāo)本檢出率低下，從而造成事實(shí)上的假陰性漏檢，而且目前大多數(shù)醫(yī)院都沒有開展軍團(tuán)菌檢測(cè)的條件和技術(shù)，對(duì)軍團(tuán)菌的預(yù)防和治療十分不利。因此通過監(jiān)測(cè)，并運(yùn)用PCR的高靈敏度、強(qiáng)特異度和快速報(bào)告等特點(diǎn)，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)病人，提供鑒別診斷，為預(yù)防和控制軍團(tuán)菌感染的爆發(fā)和流行提供科學(xué)依據(jù)。一、目標(biāo)開展軍團(tuán)菌病的監(jiān)

16、測(cè)，了解軍團(tuán)菌感染的本底水平，及時(shí)發(fā)現(xiàn)隱患，預(yù)防和控制軍團(tuán)菌病的暴發(fā)與流行。二、監(jiān)測(cè)內(nèi)容與方法（一）監(jiān)測(cè)對(duì)象：軍團(tuán)菌病監(jiān)測(cè)病例的定義：臨床診斷為肺炎的住院病例，排除已有明確其他病原學(xué)診斷的肺炎病例均作為監(jiān)測(cè)對(duì)象。（二）監(jiān)測(cè)時(shí)間監(jiān)測(cè)時(shí)間為每年的5-11月份。（三）監(jiān)測(cè)地點(diǎn)：分別在寧波市、嘉興市兩地，選擇具有代表性的綜合性醫(yī)院作為監(jiān)測(cè)點(diǎn)醫(yī)院。（四）監(jiān)測(cè)內(nèi)容：監(jiān)測(cè)單位選擇呼吸內(nèi)科病房作為監(jiān)測(cè)點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)各類肺炎和不明原因發(fā)熱病人，并填寫肺炎和不明原因發(fā)熱病人登記表。按照軍團(tuán)菌病監(jiān)測(cè)病例的定義，對(duì)符合軍團(tuán)菌病監(jiān)測(cè)病例的對(duì)象，填寫監(jiān)測(cè)病例個(gè)案調(diào)查表。監(jiān)測(cè)單位每月將上月肺炎或病例登記表和軍團(tuán)菌病監(jiān)測(cè)病例個(gè)案調(diào)

17、查表上報(bào)省疾病預(yù)防控制中心，每月不少于10例。（五）標(biāo)本的采集和運(yùn)送1. 血液標(biāo)本：雙份血清，第一份血液標(biāo)本于病人入院時(shí)采集2-3ml血液分離血清作血清學(xué)診斷；第二份血液于病人出院時(shí)采集2-3ml。血清于-20冰箱保存。2. 支氣管肺泡灌洗液、胸水、痰液或纖支氣管鏡標(biāo)本：取標(biāo)本后立即送檢，如標(biāo)本放置30min以上時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本放4冰箱，如放置24-48小時(shí)，則應(yīng)放-20以下保存。應(yīng)避免反復(fù)凍融。3. 大型醫(yī)院、賓館等冷卻水樣：采集水樣500ml/份，取樣后立即送檢。如標(biāo)本需放置30min以上時(shí)，應(yīng)放于4保存。24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。三. 各有關(guān)單位的職責(zé)與分工（一）省疾病預(yù)防控制中心：1. 組織省內(nèi)地區(qū)

18、（市）級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)開展軍團(tuán)菌病監(jiān)測(cè)工作，負(fù)責(zé)進(jìn)行軍團(tuán)菌監(jiān)測(cè)技術(shù)指導(dǎo)、質(zhì)控、和考評(píng)；2. 負(fù)責(zé)標(biāo)本的收集和檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果及時(shí)反饋至有關(guān)監(jiān)測(cè)醫(yī)院；3. 負(fù)責(zé)監(jiān)測(cè)資料的收集匯總，并進(jìn)行分析總結(jié)；4. 組織開展軍團(tuán)菌病爆發(fā)疫情調(diào)查。（三）寧波市、嘉興市疾病預(yù)防控制中心：1. 負(fù)責(zé)轄區(qū)內(nèi)監(jiān)測(cè)醫(yī)院標(biāo)本采集和上送。2. 指導(dǎo)開展監(jiān)測(cè)醫(yī)院軍團(tuán)菌病的監(jiān)測(cè)工作；3. 負(fù)責(zé)監(jiān)測(cè)資料的收集匯總。（六）監(jiān)測(cè)醫(yī)院1. 負(fù)責(zé)呼吸內(nèi)科門診及病房各類肺炎和不明原因發(fā)熱病人的統(tǒng)計(jì)匯總；負(fù)責(zé)填寫軍團(tuán)菌監(jiān)測(cè)病例個(gè)案調(diào)查表；2. 負(fù)責(zé)標(biāo)本采集，將標(biāo)本妥善保存并上送；3. 將實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果反饋給病人或負(fù)責(zé)治療該病人的醫(yī)生。四. 考核與評(píng)估每年組織對(duì)各監(jiān)測(cè)點(diǎn)醫(yī)院進(jìn)行督導(dǎo)檢查，保證監(jiān)測(cè)工作的落實(shí)?？己藘?nèi)容包括：報(bào)表上報(bào)的及時(shí)性、標(biāo)本采集的質(zhì)量和數(shù)量及上送的及時(shí)性等。附件：1. 軍團(tuán)菌肺炎監(jiān)測(cè)病例登記表2. 軍團(tuán)菌肺炎監(jiān)測(cè)病例個(gè)案調(diào)查表3. 軍團(tuán)菌檢測(cè)方法實(shí)施細(xì)則軍團(tuán)菌肺炎監(jiān)測(cè)病例登記表監(jiān)測(cè)點(diǎn)：_ 月份：_編號(hào)姓名性別年齡住址聯(lián)系電話調(diào)查日期軍團(tuán)菌肺炎監(jiān)測(cè)病例個(gè)案調(diào)查表編號(hào)：1一般情況：1.1姓名： 1.3性別： 男 女 1.4年齡(歲)： 1.5職業(yè)： 幼托或散居兒童 學(xué) 生 教 師 醫(yī)院工作人員 保育保姆 餐 飲 業(yè) 商業(yè)服務(wù) 工 人 民 工 農(nóng) 民 干部職員 離退人員 家務(wù)待業(yè) 其 他1.6現(xiàn)居住地(詳填)：省 市